一种检测铁皮石斛的核酸组合、试剂盒以及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测铁皮石斛的核酸组合、试剂盒以及方法，涉及分子生物学技术领域。本发明专利技术公开的检测铁皮石斛的核酸组合SEQ ID NO.1‑2所示的内引物组和SEQ ID NO.3‑4所示的外引物组。该核酸组合通过LAMP技术可快速、特异、灵敏、简便的检测出铁皮石斛。

Nucleic acid combination, kit and method for detecting Dendrobium officinale

The invention discloses a nucleic acid combination, a kit and a method for detecting Dendrobium officinale, and relates to the field of molecular biology. The invention discloses a group of outer primers to detect the Dendrobium SEQ ID NO.1 nucleic acid shows 2 inner primers and SEQ group ID NO.3 shown in figure 4. The nucleic acid combination can be used for rapid, specific, sensitive and simple detection of Dendrobium officinale by LAMP technology.

【技术实现步骤摘要】
一种检测铁皮石斛的核酸组合、试剂盒以及方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体而言，涉及一种检测铁皮石斛的核酸组合、试剂盒以及方法。
技术介绍
铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)属兰科石斛属，俗称铁皮兰、黑节草，是我国传统名贵中药。现代药理研究表明，铁皮石斛具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用，因此在临床中被广泛应用。铁皮石斛是中国药典记录加工枫斗的唯一来源，是石斛类药材中一个较为著名的商品，常被视为价格昂贵的极品。在《中华人民共和国药典》2015年版中更是被单独分列出来。但目前市场上流通的商品铁皮石斛中混杂较多，民间用于枫斗加工的材料也是五花八门。市场上有30余种石斛属及部分石仙桃属、金石斛属和石豆兰属植物在市场上冒充铁皮石斛和其它药用石斛。对于石斛干品而言，加工后的干品外形非常相似，依靠经典的鉴定方法则更难鉴别。此外，来源不同的铁皮石斛在化学成分上也有较大差异，严重影响了商品铁皮石斛质量的稳定性。近年来发展的以分子生物学为基础的检测方法如DNA条形码、位点特异性PCR等尽管克服了传统鉴别方法准确度不高、主观性大等缺点，在实验室条件下实现了铁皮石斛的准确检测，但是由于常规PCR需要昂贵的PCR仪或测序仪以及凝胶电泳以及成像系统等，大大限制了这些检测方法的推广应用。因此，建立适用于铁皮石斛的准确、快速、低成本的检测方法一直是中药鉴定领域中亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测铁皮石斛的核酸组合，该核酸组合可快速、特异、灵敏、简便的鉴别铁皮石斛真伪。本专利技术的另一目的在于提供上述核酸组合的应用。本专利技术的另一目的在于提供一种检测铁皮石斛的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种检测铁皮石斛的方法，该方法可实现在药市、药房、产地等快速、特异、灵敏、简便的鉴别出铁皮石斛真伪的目的。本专利技术是这样实现的：一种检测铁皮石斛的核酸组合，其包括SEQIDNO.1-2所示的内引物组和SEQIDNO.3-4所示的外引物组。上述的核酸组合在检测铁皮石斛中的应用。上述的核酸组合在制备用于检测铁皮石斛的试剂盒中的应用。一种检测铁皮石斛的试剂盒，其包括上述的核酸组合。一种检测铁皮石斛的方法，其包括：采用上述的核酸组合对待测样品进行LAMP反应。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的提供的核酸组合，其包括SEQIDNO.1-2所示的内引物组和SEQIDNO.3-4所示的外引物组。该核酸组合通过LAMP技术可快速、特异、灵敏、简便的检测出铁皮石斛；相应地，本专利技术提供的检测铁皮石斛的方法，具有以下优点：(1)检测时间短，仅40分钟即可获得检测结果，比现有的分子生物学检测方法缩短2-3小时。(2)对仪器设备要求低，不需要普通PCR所用的PCR仪、电泳槽及凝胶成像系统，只要一个水浴锅即可完成检测反应，可实现现场检测。(3)操作简单，整个过程不涉及复杂的仪器设备，检测结果清晰，只用肉眼在日光下观察观察颜色即可判断。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例3提供的采用实施例1提供的核酸组合检测不同品种石斛的结果；图2为本专利技术实施例4提供的对实施例1提供的核酸组合的特异性验证结果。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的一种检测铁皮石斛的核酸组合、试剂盒以及方法进行具体说明。以环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术为代表的核酸等温扩增技术的问世，解决了核酸分子标记鉴别方法上的诸多难题，使其作为快速鉴定成为可能。LAMP是一种快速的核酸扩增技术，利用特异引物及链置换DNA聚合酶在恒温条件下自循环几十分钟，就可完成核酸扩增反应。LAMP法操作十分简单，对仪器设备要求低，结果的检测也很简便快捷，十分适合基层快速鉴别。与传统PCR技术相比，核酸恒温扩增具有快速高效，且不需要专用的仪器等优点。LAMP方法因其具有高特异性、高灵敏性、简便、快速、低成本等特点，已在病原体检测和疾病的快速基因诊断等诸多领域应用，取得了可喜的成就。但目前尚未见到利用LAMP技术鉴别铁皮石斛的报道。一方面，本专利技术提供了检测铁皮石斛的核酸组合，其包括SEQIDNO.1-2所示的内引物组和SEQIDNO.3-4所示的外引物组。SEQIDNO.1-2所示的内引物组包括：正向内引物和反向内引物；其中，正向内引物(3-TP-FIP)碱基序列为：5’-TGGGAGATTAGGCACGGAGAGACAAGGCCAACCGGCTAAG-3’(SEQIDNO.1)；反向内引物(3-TP-BIP)碱基序列为：5’-AATAAGGCTCGGATGTGCATGGAGATGACCCGCCCTTCAG-3’(SEQIDNO.2)。SEQIDNO.3-4所示的外引物组包括：正向外引物和反向外引物；其中，正向外引物(3-TP-F3)碱基序列为：5’-TCGAGTCTTTGAACGCAAGT-3’(SEQIDNO.3)；反向外引物(3-TP-B3)碱基序列为：5’-CCCCTTATTGTTGGCAACCA-3’(SEQIDNO.4)。本专利技术提供的核酸组合通过生物信息学分析铁皮石斛及同属近缘植物的序列差异，基于铁皮石斛ITS序列(GenBank登录号：HQ114245.1)，应用LAMP在线设计软件进行引物设计与筛选得到。同时，为了增强该核酸组合的特异性，本专利技术的专利技术人选择错配位点集中在B1C区5’端的一套引物(扩增起始位点)，并在反向内引物(3-TP-BIP)的B1C区的5’端倒数第二个碱基(如下划线部分所示)处人为引入错配将C改为A，使得该B1C区的5’端与其他种石斛对应位置有5个以上碱基的差异，以增加引物特异性。以增加该引物的特异性，实现该核酸组合对目的片段的特异性扩增效果。采用本专利技术提供的核酸组合，通过LAMP技术，可快速、特异、灵敏、简便的检测出铁皮石斛。另一方面，本专利技术提供了上述的核酸组合在检测铁皮石斛中的应用。另一方面，本专利技术提供了上述的核酸组合在制备用于检测铁皮石斛的试剂盒中的应用。另一方面，本专利技术提供了一种检测铁皮石斛的试剂盒，其包括上述的核酸组合。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，该试剂盒还包括：用于等温扩增反应的缓冲液、dNTPs、mg2+、链置换DNA聚合酶以及具有与dsDNA结合能力的荧光染料中的任意一种或至少二种的组合。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，上述荧光染料为SYBRGreenI。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，链置换DNA聚合酶为Bst2.0WarmStartDNA聚合酶。还有一方面，本专利技术提供了一种检测铁皮石斛的方法，其包括：采用上述的核酸组合对待测样品进行L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测铁皮石斛的核酸组合，其特征在于，其包括SEQ ID NO.1‑2所示的内引物组和SEQ ID NO.3‑4所示的外引物组。

【技术特征摘要】
1.一种检测铁皮石斛的核酸组合，其特征在于，其包括SEQIDNO.1-2所示的内引物组和SEQIDNO.3-4所示的外引物组。2.权利要求1所述的核酸组合在检测铁皮石斛中的应用。3.权利要求1所述的核酸组合在制备用于检测铁皮石斛的试剂盒中的应用。4.一种检测铁皮石斛的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的核酸组合。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于等温扩增反应的缓冲液、dNTPs、mg2+、链置换DNA聚合酶以及具有与dsDNA结合能力的荧光染料中的任意一种或至少二种的组合。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为SY...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴文如，杨璐，
申请(专利权)人：广州中医药大学，
类型：发明
国别省市：广东,44