一种通过碱性蛋白胨水增菌筛查肠道样本中mcr‑3阳性细菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过碱性蛋白胨水增菌筛查肠道样本中质粒或者染色体介导多粘菌素耐药基因mcr‐3的细菌的方法。将肠道样本接种到碱性蛋白胨水中进行增菌后，肉汤进行直接PCR检测mcr‐3，将直接PCR检测获得的mcr‐3阳性肉汤样本接种到SS(Salmonella Shigellaagar)平板上进行筛选分纯，分纯后的细菌通过二次PCR检测mcr‐3，筛选出mcr‐3阳性细菌；本发明专利技术首先经过碱性蛋白胨水增菌富集，提高气单胞菌属和弧菌属等的分离，其次通过得到mcr‐3阳性的碱性蛋白胨水，减少分纯及后期分纯细菌的PCR工作量，可应用在肠道样本筛选耐药基因mcr‐3阳性细菌。

A method by enrichment in alkaline peptone water samples in MCR intestinal bacteria screening 3 positive bacteria

The invention discloses a method by enrichment in alkaline peptone water samples of intestinal bacteria screening plasmids or chromosome mediated polymyxin MCR resistance gene - 3 bacteria. The intestinal samples were inoculated into alkaline peptone water after enrichment broth, detection of MCR - PCR 3 PCR directly, will directly measured by MCR - 3 positive samples were inoculated into SS broth (Salmonella Shigellaagar) tablet were screened pure, pure bacteria after two times through the detection of PCR MCR - 3. Selected MCR - 3 positive bacteria; the invention first after alkaline peptone water enriched, improve the separation of Aeromonas and Vibrio, followed by MCR - 3 positive alkaline peptone water, reduce the workload of pure and late pure bacterial PCR, can be used in the screening of intestinal samples resistance gene MCR - 3 positive bacteria.

【技术实现步骤摘要】
一种通过碱性蛋白胨水增菌筛查肠道样本中mcr-3阳性细菌的方法
本专利技术属于分子生物学和医学微生物
，尤其涉及一种从人体或者动物肠道样本中筛选出质粒或者染色体介导多粘菌素耐药基因mcr‐3的细菌的方法。
技术介绍
抗生素耐药问题是21世纪全球公共卫生领域最大的挑战之一。众多抗生素的大量使用，导致耐药菌株不断增长。临床上应用广泛的β‐内酰胺类抗生素，因质粒介导耐药基因的出现，其耐药菌株以惊人的速度增长。超广谱β‐内酰胺酶(extended‐spectrumbeta‐lactamases，ESBLs)因其对三代、四代头孢菌素及氨曲南等抗生素强大的水解活性而引起广泛关注。自本世纪初开始，欧洲抗生素耐药监测网(TheEuropeanAntimicrobialResistanceSurveillanceNetwork)就对三代和四代头孢菌素耐药的侵袭性大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的分离率呈逐年上升趋势进行了相关报道。近十年来，碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌(carbapenem‐resistantEnterobacteriaceae，CRE)呈全球范围克隆传播一度引起全球恐慌。由于耐药菌株的出现，临床可用抗生素受到局限，而依赖于新药开发的速度远远达不到耐药细菌出现的速度，在这样的情况下，“老药新用”有着独特的意义。多粘菌素是一种聚阳离子抗菌肽，能与革兰阴性菌细胞膜的磷脂中带阴性电荷的磷酸根结合，破坏细胞膜的正常结构和功能，导致细菌死亡。多粘菌素包括多粘菌素A‐E，目前市场上主要是多粘菌素B和多粘菌素E(黏菌素)。多粘菌素对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌属细菌和铜绿假单胞菌等革兰阴性杆菌有着显著的体外抗菌活性。近年来，由于缺乏其他有效的抗菌药物，多粘菌素被认为是治疗碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌及产KPC型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌等所致的严重感染的重要选择。随之而来的是多粘菌素在临床使用量的增加，2000年‐2010年的全球抗生素销售量调查表明十年期间多粘菌素在临床的消耗量增长了13％。虽然，目前一些针对CRE的新抗菌药，例如头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦，可有效抑制KPC酶的活性，但是无法抑制金属酶(包括目前在许多国家迅速传播的NDM)以及KPC的变异体，使得临床医生和微生物学者被迫重新评估多粘菌素的临床价值。值得引起警惕的是，随着针对CRE研究的进一步深入以及黏菌素在临床上应用量的增加，对黏菌素耐药的CRE菌株开始出现，而黏菌素耐药CRE菌株的出现将使目前形势严峻的临床抗感染治疗局面进一步加剧，甚至是陷入彻底的无药可用的困境。以往的大量研究发现多粘菌素耐药最主要的机制是脂质A的改变，从而导致多粘菌素亲和力的降低。大多由染色体介导的双组份调控系统(pmrAB和phoPQ，肺炎克雷伯菌中还有负调控子mgrB)起着主要的作用。2015年底我们团队在《柳叶刀感染病杂志》首次报道了一种新型的质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr‐1，序列比对分析表明MCR‐1属于磷酸乙醇胺转移酶；通过质谱对含有MCR‐1蛋白的细菌分析表明该功能蛋白通过修饰细胞膜上的脂质A而介导细菌对多粘菌素耐药。mcr‐1可在大肠杆菌之间传播，还可以传到肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌，这些结果证明该质粒介导的耐药性可以跨种属的快速传播，并且质粒非常稳定，即使没有多粘菌素的选择性压力，也会稳定存在并广泛传播。而且，同时携带碳青霉烯耐药基因(blaNDM和blaKPC)和mcr‐1肠杆菌科细菌的出现，使得对多重耐药细菌引起的感染治疗更为棘手。此外，6种mcr‐1变异体，分别为mcr‐1.2，mcr‐1.3，mcr‐1.4，mcr‐1.5，mcr‐1.6，mcr‐1.7，以及第二种新型质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr‐2，相继于不同国家被报道。2017年我们团队在mBio杂志首次报道了第三种新型的质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr‐3。序列比对分析表明mcr‐3的核苷酸序列与mcr‐1和mcr‐2的一致性仅为45.0％和47.0％，MCR‐3属于磷酸乙醇胺转移酶，与临床感染分离和环境来源的肠杆菌科和气单胞菌属细菌的磷酸乙醇胺转移酶序列高度一致。而且，在携带mcr‐3的质粒上发现位于mcr‐3基因上游有仅于鲑鱼气单胞菌中表达的截短转座子元件TnAs2。mcr‐3可在肠杆菌科细菌和气单胞菌属之间传播，这些结果证明该质粒介导的耐药性可以跨种属快速传播，而气单胞菌属很可能作为mcr‐3的潜在储存库。人体和动物肠道定植了大量肠杆菌科细菌，细菌种类多密度高，因此也成为耐药菌的定植场所。同样，在周围的环境包括：水、土壤、公共场所的物表等环境也是大量细菌定植场所，因此对这些细菌中的耐药菌进行检测具有非常重要的意义。由于mcr‐3编码的磷酸乙醇胺转移酶的氨基酸序列与气单胞菌属细菌的磷酸乙醇胺转移酶的氨基酸序列高度一致，故本团队选用碱性蛋白胨水增菌以提高气单胞菌属的分离，从而提高mcr‐3阳性细菌的分离率。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足和缺陷，提供一种通过碱性蛋白胨水增菌筛查肠道样本中mcr‐3阳性细菌的方法，以大大提高样本中的阳性率。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：一种通过碱性蛋白胨水增菌筛查肠道样本中mcr‐3阳性细菌的方法，该方法包括如下步骤：步骤1：将人体或者动物肠道样本接种到碱性蛋白胨水中进行增菌；所述碱性蛋白胨水pH为8.4～9.2，包含15.0g/L的蛋白胨(tryptone)，4.0g/L的牛肉膏(BeefExtract)，10.0g/L的NaCl。步骤2：对步骤1増菌后的肉汤进行直接PCR检测；步骤3：将直接PCR检测获得的mcr‐3阳性肉汤样本接种到SS平板上进行筛选分纯；步骤4：分纯后的细菌通过二次PCR检测mcr‐3，筛选出mcr‐3阳性细菌。进一步地，所述步骤1中肠道标本接种的处理方式为:将人体或者动物肠道中的样本挑取火柴头大小接种到5ml碱性蛋白胨水中，将接种后的肉汤样本置37℃孵箱孵育24‐48小时，待试验用。进一步地，所述步骤2中对步骤1増菌后的肉汤进行直接PCR检测指：取步骤1増菌24‐48小时后的肉汤直接PCR扩增耐药基因mcr‐3，从而筛选出mcr‐3阳性的肉汤。进一步地，所述SS平板筛选分纯是指取上述直接PCR检测获得的mcr‐3阳性肉汤接种到SS平板上孵育18‐24小时，挑取单菌落转划至新SS平板分纯，孵育18‐24小时。进一步地，所述分纯后细菌二次PCR检测mcr‐3指将上述分纯后细菌PCR扩增耐药基因mcr‐3，从而筛选出mcr‐3阳性细菌。本专利技术的有益效果是，本专利技术和前期筛选方法相比，具有如下技术效果：①本专利技术首先经过碱性蛋白胨水增菌富集，提高气单胞菌属和弧菌属等的分离。②本专利技术其次通过得到mcr‐3阳性的碱性蛋白胨水，减少分纯及后期分纯细菌的PCR工作量。附图说明图1为营养肉汤PCR电泳图；图2为营养肉汤分离的单菌落PCR电泳图；图3为碱性蛋白胨水PCR电泳图；图4为碱性蛋白胨水分离的单菌落PCR电泳图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。取某人体肠道样本，平均分成两份，每份火柴头大小，分别按照实施例1和2所述的方法对mcr‐3阳性细菌进行筛选。实施例11.样本前处本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过碱性蛋白胨水增菌筛查肠道样本中mcr‐3阳性细菌的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤1：将肠道样本接种到碱性蛋白胨水中进行增菌；所述碱性蛋白胨水pH为8.4～9.2，包含15.0g/L的蛋白胨(tryptone)，4.0g/L的牛肉膏(Beef Extract)，10.0g/L的NaCl。步骤2：对步骤1増菌后的肉汤进行直接PCR检测；步骤3：将直接PCR检测获得的mcr‐3阳性肉汤样本接种到SS平板上进行筛选分纯；步骤4：分纯后的细菌通过二次PCR检测mcr‐3，筛选出mcr‐3阳性细菌。

【技术特征摘要】
1.一种通过碱性蛋白胨水增菌筛查肠道样本中mcr‐3阳性细菌的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤1：将肠道样本接种到碱性蛋白胨水中进行增菌；所述碱性蛋白胨水pH为8.4～9.2，包含15.0g/L的蛋白胨(tryptone)，4.0g/L的牛肉膏(BeefExtract)，10.0g/L的NaCl。步骤2：对步骤1増菌后的肉汤进行直接PCR检测；步骤3：将直接PCR检测获得的mcr‐3阳性肉汤样本接种到SS平板上进行筛选分纯；步骤4：分纯后的细菌通过二次PCR检测mcr‐3，筛选出mcr‐3阳性细菌。2.根据权利要求1所述的筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：张嵘，王汉宇，黄子衔，孙巧玲，李佳萍，
申请(专利权)人：张嵘，
类型：发明
国别省市：浙江,33