由多能干细胞向角膜上皮细胞的分化诱导制造技术

本发明专利技术涉及由多能干细胞分化诱导角膜上皮细胞的方法。更详细而言，涉及下述方法：在不使用饲养细胞的情况下，在无血清培养基中使人iPS细胞等多能干细胞自主地分化为外胚层系细胞种类，并将得到的眼表外胚层系列细胞分化诱导为角膜上皮细胞。

Differentiation of multipotent stem cells into corneal epithelial cells

The present invention relates to a method for inducing corneal epithelial cells by differentiation of pluripotent stem cells. In particular, involves the following methods: in the case without the use of feeder cells, in the medium to iPS cell pluripotent stem cells to differentiate into ectoderm independent cell types without serum, and then the ocular surface ectoderm cells induced by series of differentiation into corneal epithelial cells.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由多能干细胞向角膜上皮细胞的分化诱导
相关申请本申请基于日本专利申请2015-006074(申请日为2015年1月15日)主张优先权，其内容通过参考并入本说明书中。本专利技术涉及从多能干细胞(pluripotentstemcells)分化诱导角膜上皮细胞的方法。更详细而言，涉及下述方法：在不使用饲养细胞的情况下，在无血清培养基中使多能干细胞(尤其是人工多能干细胞)自主地分化为外胚层系细胞种类(日文：細胞種)，并将得到的眼表外胚层系列细胞分化诱导为角膜上皮细胞。
技术介绍
近年来，通过对未分化的细胞(干细胞)进行分化诱导而实现对受损的组织器官加以修补的再生医疗(细胞医疗)的研究正在不断发展。尤其是胚胎干细胞(ES细胞)因能分化为除胎盘以外的所有细胞，因此，对其向各细胞谱系的分化诱导、对其分化决定因子的鉴定受到瞩目，但是，由于在建立时破坏受精卵这样的伦理性问题，导致其研究、利用受到颇多制约，另外，由于无法建立来源于接受移植的患者的ES细胞，所以还存在排斥反应的问题，因此，现状是胚胎干细胞的适用疾病受限，其在临床中的有用性尚未明确。相对于此，通过向体细胞、未分化的干细胞导入特定的因子而建立了具有与ES细胞同样的分化多能性的人工多能干细胞。作为其代表，有山中等人所建立的iPS细胞。利用了这些人工多能干细胞的再生医疗不仅不存在伦理性问题，而且，通过以来源于患者的细胞作为细胞源(source)，还能够避免排斥反应的问题。有报道称，能够利用人iPS细胞、ES细胞来分化诱导上皮细胞(专利文献1、非专利文献1～2)。经诱导的上皮细胞中有很多表达角蛋白14、p63这样的复层上皮细胞的标志物，并且，也可能使其分化为皮肤上皮等复层上皮系列细胞。本申请的专利技术人对于向复层上皮中的角膜上皮的分化进行了报道(专利文献2～3、非专利文献3)，但是，对于临床应用而言，无法片化、无法诱导增殖能力高的角膜上皮前体细胞、以及使用了饲养细胞均成为问题。为了进行临床应用，期望能够在不使用饲养细胞的情况下由人iPS细胞制备具有复层化的功能性组织结构、标志物的表达(尤其是角蛋白12、pax6、MUC16)的角膜上皮片，但迄今为止尚未有这样的报道。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2012/073238号专利文献2：WO2010/134619号专利文献3：WO2012/144582号非专利文献非专利文献1：Guenou,H.,etal.,.TheLancet374,(2009)p1745-1753.非专利文献2：Metallo,C.M.,etal.,Stemcells(2008)26,372-380.非专利文献3：R.Hayashietal.,Volume7,Issue9,e45435,PLOSONE,2012
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的课题在于，提供在不使用饲养细胞、血清的情况下将多能干细胞(尤其是人工多能干细胞)分化诱导为角膜上皮、结膜上皮等眼表上皮系列的方法，以及，利用多能干细胞(尤其是人工多能干细胞)而提供复层化的功能性培养角膜上皮细胞片。用于解决课题的手段为了解决上述课题，本申请的专利技术人进行了锐意研究，结果发现，在不使用血清、饲养细胞的情况下于含有KSR等的分化培养基中培养人iPS细胞时，细胞在4周左右时自主地分化，形成包含由各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层的(多层状的)集落(colony)。此外，还发现通过下述方法能够得到复层化的角膜上皮细胞：从得到的集落中分离包含上皮干细胞的眼表外胚层系列细胞，对角膜上皮前体细胞进行分化诱导、并将其单独分离出，进而进行成熟培养。得到的角膜上皮细胞能够以片状回收并进行移植，并确认到其与来源于体细胞的角膜上皮细胞同样地能在体外(invitro)及体内(invivo)作为角膜上皮而发挥功能。本专利技术是基于上述的见解而完成的，其涉及以下(1)～(15)。(1)制备下述集落的方法，所述集落包含由各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层，所述方法中，在不使用饲养细胞的情况下于无血清培养基中对多能干细胞进行二维培养，由此制备所述集落；(2)如上述(1)所述的方法，其特征在于，通过多能干细胞的自主分化，形成由不同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层；(3)如上述(1)或(2)所述的方法，其特征在于，无血清培养基不含有0.5nM以上的BMP4(骨形态发生蛋白4，Bonemorphogeneticprotein4)、转化生长因子(Transforminggrowthfactor)、及激活素(activin)；(4)如上述(3)所述的方法，其特征在于，无血清培养基还不含有选自高浓度视黄酸、BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、及头蛋白(Noggin)中的至少1种以上；(5)如上述(1)～(4)中任一项所述的方法，其特征在于，使用经选自胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白(laminin)或层粘连蛋白片段、玻连蛋白、基底膜基质、明胶、透明质酸、多聚赖氨酸(polylysine)、玻连蛋白、及透明质酸中的任意一种以上包被的容器来培养多能干细胞；(6)如上述(1)～(5)中任一项所述的方法，其中，集落包含分别由神经外胚层系列细胞、神经嵴系列细胞/眼胚系列细胞、眼表外胚层(ocularsurfaceectoderm)系列细胞、及表面外胚层(surfaceectoderm)系列细胞构成的层；(7)眼相关细胞的制备方法，其包括下述步骤：通过上述(1)～(6)中任一项所述的方法制备集落的步骤，所述集落包含由各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层；从所述集落中分离特定的层中包含的细胞的步骤；及将所述细胞分化诱导为眼相关细胞的步骤；(8)如上述(7)所述的方法，其中，眼相关细胞为选自角膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、神经视网膜细胞、结膜上皮细胞、角膜缘上皮细胞、角膜内皮细胞、角膜基质细胞、虹膜基质细胞、巩膜细胞、虹膜色素上皮细胞、睫状体上皮细胞、视神经细胞、角膜缘下成纤维细胞、结膜下成纤维细胞、泪腺、睑板腺、杯状细胞、晶状体上皮细胞、及眼睑上皮细胞中的任一种；(9)角膜上皮细胞的制备方法，其包括下述步骤：通过上述(1)～(6)中任一项所述的方法制备集落的步骤，所述集落包含由各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层；在含有生长因子的培养基中培养所述集落的步骤；分离由眼表外胚层系列细胞构成的层中包含的细胞，在含有KGF、Rock抑制剂、及血清替代物的培养基中进行培养，从而分化诱导为角膜上皮前体细胞的步骤；及将角膜上皮前体细胞单独分离出，分化诱导为角膜上皮细胞的步骤；(10)如上述(9)所述的方法，其特征在于，以选自ITGβ4、SSEA4、TRA-1-60、及CD200中的1种或2种以上的标志物有无表达(优选为ITGβ4阳性及SSEA4阳性，更优选为TRA-1-60或CD200阴性、且ITGβ4阳性及SSEA4阳性，进一步优选为CD200阴性、且ITGβ4阳性及SSEA4阳性)作为指标，来单独分离角膜上皮前体细胞；(11)角膜上皮细胞，其特征在于，所述角膜上皮细胞是通过上述(9)或(10)所述的方法制备的，并且为K12、pax6、及p63阳性；(12)角膜细胞片的制备方法，其包括下述步骤：通过上述(9)或(10)所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备下述集落的方法，所述集落包含由各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层，所述方法中，在不使用饲养细胞的情况下于无血清培养基中对多能干细胞进行二维培养，由此制备所述集落。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.15 JP 2015-0060741.制备下述集落的方法，所述集落包含由各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层，所述方法中，在不使用饲养细胞的情况下于无血清培养基中对多能干细胞进行二维培养，由此制备所述集落。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过多能干细胞的自主分化，形成由不同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，无血清培养基不含有0.5nM以上的BMP4(骨形态发生蛋白4)、转化生长因子、及激活素。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，无血清培养基还不含有选自高浓度视黄酸、BMP抑制剂、TGFβ抑制剂、及头蛋白中的至少1种以上。5.如权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，使用经选自胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或层粘连蛋白片段、玻连蛋白、基底膜基质、明胶、透明质酸、多聚赖氨酸、玻连蛋白、及透明质酸中的任意一种以上包被的容器来培养多能干细胞。6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，集落包含分别由神经外胚层系列细胞、神经嵴系列细胞/眼胚系列细胞、眼表外胚层系列细胞、及表面外胚层系列细胞构成的层。7.眼相关细胞的制备方法，其包括下述步骤：通过权利要求1～6中任一项所述的方法制备集落的步骤，所述集落包含由各不相同的外胚层系细胞种类构成的同心圆状的层；从所述集落中分离特定的层中包含的细胞的步骤；及将所述细胞分化诱导为眼相关细胞的步骤。8.如权利要求7所述的方法，其中，眼相关细胞为选自角膜上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、神经视网膜细胞、结膜上皮细胞、角膜缘上皮细胞、角膜内皮细胞、角膜基质细胞、虹膜基质细胞、巩膜细胞、虹膜色素上皮细胞、睫状体上皮细...

【专利技术属性】
技术研发人员：西田幸二，林龙平，石川幸，
申请(专利权)人：国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP