提取分化细胞的方法技术

一种用于在诱导多能干细胞分化后从包含未分化细胞的细胞群中提取分化细胞的方法。一种用于从细胞群中提取分化细胞的方法，包括以下步骤：(1)将包含与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA引入到细胞群中的步骤；和(2)提取标记基因已经被翻译的细胞的步骤。

Method for extracting differentiated cells

A method for extracting differentiated cells from a cell population containing undifferentiated cells after differentiation of induced pluripotent stem cells. A method for the differentiation of cells extracted from cells, which comprises the following steps: (1) will be included with the target sequence in the pluripotent stem cell specific expression of miRNA is operably linked to marker gene mRNA into cells in steps; and (2) extracting marker genes have been translated the steps of cell.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提取分化细胞的方法
本专利技术涉及使用在多能干细胞中特异性表达的miRNA作为指示剂提取分化细胞的方法。
技术介绍
细胞疗法已经受到关注，在细胞疗法中，多能干细胞如iPS细胞或ES细胞被诱导以分化成期望的细胞，然后将分化细胞施用到体内。然而，即使在分化诱导完成后，未分化细胞仍可能残留，因此已经有人指出，如果施用包含这种未分化细胞的细胞群，则会导致癌变(非专利文献1)。因此，已经研究了使用在多能干细胞中高度表达的细胞表面标记物作为指示剂来去除这种残留的未分化细胞的方法。然而，在多能干细胞中高度表达的细胞表面标记物在分化的细胞中不表达的情况并不总是发生。即使在多能干细胞中高度表达的细胞表面标记物为阴性的细胞被提取，也存在未分化细胞不能被完全去除的情况。此外，这种细胞表面标记物的类型有限，并且难以找到更特异的标记物。引用文献列表非专利文献非专利文献1：MiuraK，等人，NatBiotechnol.200927：743-745
技术实现思路
专利技术要解决的问题期望开发出一种在诱导多能干细胞分化后从包含未分化细胞的细胞群中提取分化细胞的方法。用于解决问题的方案本专利技术人发现，利用在多能干细胞中特异性表达的miRNA，并且通过使用mRNA可以仅提取分化细胞，其中标记基因的表达被miRNA的表达抑制，从而完成本专利技术。具体地，本专利技术具有以下特征：[1]一种用于在诱导多能干细胞分化后从细胞群中提取分化细胞的方法，包括以下步骤：(1)将包含与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA引入到细胞群中的步骤；和(2)提取标记基因已经被翻译的细胞的步骤。[2]根据[1]所述的方法，其中所述多能干细胞是人类多能干细胞。[3]根据[2]所述的方法，其中在所述人类多能干细胞中特异性表达的所述miRNA是hsa-miR-302b、hsa-miR-302a或hsa-miR-367。[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中使用流式细胞仪进行所述提取步骤。[5]一种分化细胞提取试剂盒，其包括含有与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA。[6]根据[5]所述的试剂盒，其中所述多能干细胞是人类多能干细胞。[7]根据[6]所述的试剂盒，其中在所述人类多能干细胞中特异性表达的所述miRNA是hsa-miR-302b、hsa-miR-302a或hsa-miR-367。专利技术的有益效果根据本专利技术，通过利用具有与对多能干细胞特异的miRNA可操作地连接的标记基因的mRNA，可以选择性提取分化细胞。由于根据本专利技术的方法可以通过选择标记物已经转变为阳性的细胞来实现，所以本方法的特别有利之处在于其不受mRNA的引入效率的影响。另外，本专利技术的方法可以通过将mRNA引入细胞中来进行，该mRNA在约1天的半寿期(half-life)内分解，然后迅速从细胞中排出。因此，本方法不会引起问题，如由于细胞中的病毒感染或DNA的残留而对基因组造成的损害。此外，本方法的优点还在于，其可以通过使用细胞仪的简单检测方法或通过引入抗药性基因的药物选择来选择分化细胞。附图说明图1示出通过将EGFP、1×T302b-EGFP和EGFP-4×T302b引入iPS细胞中，然后在以不同浓度添加了mirVanamiRNA抑制剂的培养基中培养所述iPS细胞，然后测量所培养的iPS细胞中EGFP的荧光强度而获得的结果。在该图中，误差条表示平均值±标准偏差(n＝3)。图2示出通过测量iPS细胞中EGFP的荧光强度相对mCherry的荧光强度而获得的结果，所述iPS细胞中已经共同引入了mCherry和EGFP或mCherry和1×T302b-EGFP，并且所述iPS细胞已经培养在已经以不同浓度添加了mirVanamiRNA抑制剂的培养基中。在该图中，误差条表示平均值±标准偏差(n＝3)。图3示出通过流式细胞术测量在视黄酸培养基中培养并且未引入或已引入1×T302b-EGFP的iPS细胞中EGFP的荧光强度的结果(上部视图)，通过流式细胞术测量iPS细胞中或在视黄酸培养基中培养的iPS细胞中的Tra-1-60的表达水平的结果(中间视图)以及通过流式细胞术测量iPS细胞中或在视黄酸培养基中培养的iPS细胞中的SSEA5的表达水平的结果(下部视图)。该图中所示的数字表示所描述部分中相对于全部细胞的含量比。图4示出在视黄酸培养基中培养后引入了1×T302b-EGFP的iPS细胞中的EGFP阳性细胞(+)或EGFP阴性细胞(-)中OCT3/4的表达水平(左视图)，在视黄酸培养基中培养的iPS细胞中Tra-1-60阴性细胞(-)或Tra-1-60阳性细胞(+)中OCT3/4的表达水平(中间视图)以及在视黄酸培养基中培养的iPS细胞中的SSEA5阴性细胞(-)或SSEA5阳性细胞(+)中OCT3/4的表达水平(右视图)。图5示出通过在视黄酸培养基中培养iPS细胞后将1×T302b-EGFP引入所培养的细胞中，然后将所得到的细胞中的EGFP阳性细胞或Tra-1-60阴性细胞在mTeSR1中(上图)或视黄酸培养基(下图)中培养5天而获得的细胞的碱性磷酸酶染色图像。图6A示出通过流式细胞术测量在视黄酸培养基中培养并且引入了1×T302b-EGFP的iPS细胞中EGFP的表达水平而获得的结果。图6B示出通过在视黄酸培养基中培养iPS细胞，然后将1×T302b-EGFP引入所培养的细胞中，然后将所获得的细胞中的上(top)10％EGFP阳性细胞或上20％EGFP阳性的细胞在mTeSR1(上图)或视黄酸培养基(下图)中培养5天而获得的细胞的碱性磷酸酶染色图像。图7a是示出通过将Ctrl-hmAG1、302a-5p-hmAG1或367-3p-hmAG1共同引入无饲养层的人类iPS细胞系(201B7、1231A3和1383D7)和HeLa细胞后使用BDFACSaria-II分析hmAG1的翻译而获得的结果的描点图。图7b是示出302a-5p响应性(responsive)mRNA和367-3p响应性mRNA的翻译在人类iPS细胞中被特异性抑制并且在Hela细胞(右端条)恒定的视图。图7c是示出在将302a-5p响应性mRNA和添加量已经改变的302a-5p抑制剂共同引入Ff-201B7后，hmAG1的荧光强度与tagBFP的荧光强度的比率的图(左视图)和来自0.003nM抑制剂浓度的青色、橙色、绿色、蓝色和红色的描点图(从图的下侧到上侧)(右视图)。图7d是示出在将302a-5p响应性mRNA和添加量已改变的302a-5p模拟物共同引入Hela细胞后，hmAG1的荧光强度与tagBFP的荧光强度的比率的图(左视图)和来自0.003nM模拟物浓度的橙色、青色、紫色、蓝色和红色的描点图(从图的上侧到下侧)(右视图)。误差条表示试验重复三次时的标准误差。图8是示出通过使用302a-5p响应性mRNA和367-3p响应性mRNA追踪Ff-人类iPS细胞分化成中脑多巴胺能细胞而得到的结果的视图。图8a从左依次示出引入了302a-5p响应性mRNA的Ff-201B7细胞在第0天，第5天，第7天和第14天时的代表性描点图。在第0天，蓝色描点图(该图表中的下部点集)示出本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在诱导多能干细胞分化后从细胞群中提取分化细胞的方法，包括以下步骤：(1)将包含与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA引入到细胞群中的步骤；和(2)提取所述标记基因已经被翻译的细胞的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.16 JP 2014-1460701.一种用于在诱导多能干细胞分化后从细胞群中提取分化细胞的方法，包括以下步骤：(1)将包含与在多能干细胞中特异性表达的miRNA的靶序列可操作地连接的标记基因的mRNA引入到细胞群中的步骤；和(2)提取所述标记基因已经被翻译的细胞的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞是人类多能干细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其中在所述人类多能干细胞中特异性表达的所述miRNA是hsa...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐藤博英，远藤慧，片山翔太，卡勒姆·帕尔，
申请(专利权)人：国立大学法人京都大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP