用于生产成人肝脏祖细胞的方法技术

已基于一系列生物活性和标记物对新型成人肝脏祖细胞(称为H2干细胞)进行了表征。用于生产H2干细胞的方法能够使得此类细胞为贴壁细胞和在悬液中的三维细胞簇形式，其能够分化成具有较强肝脏特异性活性的细胞和/或能够用于治疗肝脏疾病或用于评估化合物的效能、代谢和/或毒性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及使用原代肝细胞生成的成人肝脏祖细胞并且其用于肝脏疾病的医疗管理或用于筛选具有医疗兴趣的化合物。专利
肝脏是调节机体内环境平衡的关键器官并且是多种至关重要的代谢途径的位点。在复杂的代谢途径中仅一种蛋白受损就将是非常有害的。大量存在的重要肝酶实质上会增加发生不同肝脏疾病的风险。总之，肝脏代谢存在的200种不同的先天性缺陷影响2500分之一的儿童活产。目前的治疗和长期管理并不是足够有效的。原位肝脏移植(OLT)是高度侵入性的、不可逆的，其受到供体移植物短缺的限制并且要求最尖端的手术。由于肝细胞制备物质量的影响，肝细胞移植(LCT)可能仅具有短期至中期的疗效。对细胞冻存的耐受性、永久性植入和注入细胞高功能性的进一步改进将是一个重要突破(SokalEM,2011；RussoFP和ParolaM,2012；AllamehA和KazemnejadS,2012；ParveenN等,2011)。通过使用干细胞或祖细胞将带来这种改进，特别是使用来源于不同生物体的肝脏组织以及胎儿或成人肝脏组织的在文献中已被鉴定的肝脏祖细胞(SchmelzerE等,2007；SahinMB等,2008；AzumaH等,2003；HerreraMB等,2006；NajimiM等,2007；DarwicheH和PetersenBE,2010；ShiojiriN和NitouM,2012；TanakaM和MiyajimaA,2012)。在体外暴露于肝源性刺激和/或体内施用后，此类细胞能够提供通常具有与肝分化如I/II相酶促活性相关的形态和功能特征的细胞。可以将从其中产生的这些肝脏祖细胞或肝细胞样细胞用于细胞移植以及用于新药研发中的药物检测，因为其代表了在药物代谢和在体外药理学或毒理学筛选中原代人肝细胞的替代物(DanYY,2012；HookLA,2012)。然而，目前尚无法确定到目前为止已鉴定的哪种肝脏祖细胞是针对给定疾病或用途的最佳疗法。这主要是由于表征细胞及其分化能力使用的方法存在较大差异，移植模型存在差异以及确定体内细胞移植作用采用不一致的方法。肝细胞球体或肝类器官，其是直径大于50μm的球形、多细胞的肝细胞聚集物，可以提供用于细胞移植和生物人工肝脏的有用的三维组织构建体。已将若干方法，如在用于自组装的非粘附性塑料表面上的肝细胞培养和通过旋转烧瓶的旋转培养，用于从哺乳动物的肝细胞形成球状体(LuY等,2012；SaitoR等,2011；Soto-GutierrezA等,2010；MitakaT和OoeH,2010；TostoesRM等,2012)。这些结构可以通过对细胞的三维生长提供足够的支持产生，特别是通过模拟其与肝脏微环境之间的相互作用和特别是与细胞外基质(ECM)之间的。来自体内研究的大量证据表明基质蛋白影响成人肝脏祖细胞的活化、扩增、迁移和分化，但是特定ECM蛋白在体内和体外活性中所具有的作用的信息仍是有限的(ZhuC等,2013)。已发表了ECM特异性受体在肝脏祖细胞中表达的一些证据(NajimiM等,2007；MiyazakiM等,2007)。然而，尚无证据显示如何能够在细胞培养基中生产存在肝脏标记物、间充质标记物、肝脏特异性代谢活性的特定组合的肝脏祖细胞或其他肝脏来源的低分化细胞并且形成三维细胞簇，而无需使用不适宜的和/或复杂的涉及胚胎或多能干细胞、重组DNA技术或化学物质的技术方案。专利技术概述本专利技术是基于特定细胞培养条件能够获得具有特异性表达性质和改善的生物活性的新型成人肝脏祖细胞的发现，所述新型成人肝脏祖细胞能够用于生产基于细胞的能够用于治疗肝脏疾病的药物组合物，或者能够用于鉴定化合物的效能、代谢和/或毒性的代谢性和具有肝脏活性的细胞。这些称为H2干细胞的细胞代表具有不同于在此前描述的成人肝脏祖细胞中已鉴定的那些的形态和功能性性质的细胞群，所述细胞由人源供体分离或者生产，特别地具有较高水平的提供肝脏特异性代谢活性的蛋白(例如CYP3A4活性)以及至少一种间充质标记物(例如，选自波形蛋白、CD90、CD73、CD29、CD44、α平滑肌肌动蛋白)和至少一种肝脏标记物(例如，选自白蛋、HNF-3b、HNF-4)的表达。此外，在一些实施方式中还可以提供与表征H2干细胞的标准相关的细胞内标记物，如显著存在表达细胞角蛋白19的细胞。将采用本专利技术的方法已获得或可获得的H2干细胞定义为至少一种间充质标记物(任选地选自ASMA、波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29)阳性、至少一种肝脏标记物(任选地选自HNF-4、HNF-3B和白蛋白)阳性和至少一种肝脏特异性代谢活性(任选地选自尿素分泌、胆红素缀合和CYP3A4活性)阳性的细胞群。此外，H2干细胞还可以包含一种或多种下述附加性质：包含至少20％、20％至90％或者20％至40％的细胞角蛋白19阳性细胞(当采用流式细胞术检测时)，含有Sushi结构域2的蛋白的标记物为阳性，存在立方形的间皮-上皮形态(即，与来源于中胚层的上皮细胞具有相似的形态)和/或能够形成具有肝脏特异性代谢活性的三维细胞簇。本专利技术的一个主要实施方式包括成人肝脏祖细胞，所述成人肝脏祖细胞针对下述生物活性和能够在其表面上、细胞内鉴定的和/或分泌的标记物的组合检测为阳性：(a)至少一种选自白蛋白、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的肝脏标记物；(b)至少一种选自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29的间充质标记物；(c)至少一种选自尿素分泌、胆红素缀合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性的肝脏特异性活性；(d)含蛋白2的Sushi结构域(SUSD2)；和(e)细胞角蛋白-19(CK-19)。在一些实施方式中，可以利用一系列阴性标记物进一步表征所述成人肝脏祖细胞，特别是H2干细胞可以针对CD140b、CD45、CD117、CD31、CD133和CD326中的一种或多种检测为阴性。在进一步的实施方式中，H2干细胞还可以针对下述活性和标记物中的一种或多种检测为阳性：细胞角蛋白-18(CK-18)；α平滑肌肌动蛋白(ASMA)；一种或多种凝血相关分泌蛋白(如纤维蛋白原α、纤维蛋白原β、纤维蛋白原γ、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX和因子XIII)；一种或多种其他肝脏特异性活性(如磺基转移酶活性、色氨酸-2,3-双加氧酶活性、肝脏羧化酶活性、氨代谢和糖原贮存)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种成人肝脏祖细胞，其特征为在所述细胞中下述检测为阳性：(a)至少一种选自白蛋白、HNF‑3B、HNF‑4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4的肝脏标记物；(b)至少一种选自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29的间充质标记物；(c)至少一种选自尿素分泌、胆红素缀合、α‑1‑抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性的肝脏特异性活性；(d)含有蛋白2的Sushi结构域(SUSD2)；和(e)细胞角蛋白‑19(CK‑19)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.28 US 61/870,9831.一种成人肝脏祖细胞，其特征为在所述细胞中下述检测为阳性：
(a)至少一种选自白蛋白、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、
CYP2E1和CYP3A4的肝脏标记物；
(b)至少一种选自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29的间充质
标记物；
(c)至少一种选自尿素分泌、胆红素缀合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和
CYP3A4活性的肝脏特异性活性；
(d)含有蛋白2的Sushi结构域(SUSD2)；和
(e)细胞角蛋白-19(CK-19)。
2.根据权利要求1所述的细胞，其特征为在所述细胞中CD140b、CD45、
CD117、CD31、CD133和CD326中的一个或多个检测为阴性。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞对于细胞角蛋白-18
(CK-18)和/或α平滑肌肌动蛋白(ASMA)检测也为阳性。
4.根据前述任意一项权利要求所述的细胞，其中所述细胞针对至少一个
肝脏特异性活性的检测也为阳性，所述肝脏特异性活性选自磺基转移酶活
性、色氨酸-2,3-双加氧酶活性、肝脏羧化酶活性、氨代谢和糖原贮存。
5.根据前述任意一项权利要求所述的细胞，其中所述细胞针对至少一个
凝血相关分泌蛋白的检测也为阳性，所述凝血相关分泌蛋白选自纤维蛋白原
α、纤维蛋白原β、纤维蛋白原γ、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX和
因子XIII。
6.根据前述任意一项权利要求所述的细胞，其中所述细胞检测为：
(a)白蛋白、波形蛋白、CD90、CD73、尿素分泌、胆红素缀合、α-1-
抗胰蛋白酶分泌、CYP3A4活性、含有蛋白2的Sushi结构域、细胞角蛋白
-19和肝脏羧化酶活性阳性；和
(b)CD140b阴性。
7.根据前述任意一项权利要求所述的细胞，其中所述细胞是贴壁的并且
呈现立方形间皮-上皮形态。
8.根据前述任意一项权利要求所述的细胞，其中所述细胞能够在悬液中
形成三维细胞簇和/或分化成存在肝脏特异性活性的细胞。
9.一种分离的细胞群，所述分离的细胞群包含至少60％或60％至99％
或70％至90％的前述任意一项权利要求所述的细胞。
10.根据权利要求9所述的细胞群，其中所述群包含贴壁细胞或在悬
液中形成三维细胞簇。
11.根据权利要求10所述的细胞群，其中所述群存在可诱导的I相
CYP依赖性活性和摄取牛磺胆酸盐、雌酮-3-硫酸酯和1-甲基-4-苯基吡啶中
的至少一种。
12.根据权利要求9至11中任意一项所述的细胞群，其中所述细胞群
分化成存在肝脏特异性活性的细胞。
13.根据前述任意一项权利要求所述的细胞或群，其中所述细胞或群
经由一种或多种化学试剂、细胞培养基、生长因子和/或核酸载体修饰。
14.一种获得成人肝脏祖细胞的方法，所述方法包括：
(a)解离成人肝脏或其一部分以形成原代肝细胞群；
(b)产生(a)的原代肝细胞群的制备物；
(c)将(b)制备物中包含的细胞培养到支持物上，以使得细胞向其贴
壁和生长并且出现具有立方形间皮-上皮形态的细胞群；
(d)将(c)的细胞传代至少一次；和
(e)分离步骤(d)传代后获得的细胞群，所述细胞群维持立方形间皮
-上皮形态，所述细胞群针对至少一种肝脏标记物和至少一种间充质标记物
为阳性，并且所述细胞群具有至少一种肝脏特异性活性。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述步骤(a)的原代肝细胞
是人源的。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中将所述步骤(b)的原代
肝细胞制备物冻存。
17.根据权利要求14至16中任意一项所述的方法，其中所述步骤(c)
的细胞和/或所述步骤(e)的细胞群针对至少一个选自下组的标记物检测为
阳性：细胞角蛋白19、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶分泌、含有蛋白2的Sushi
结构域和CYP3A4。
18.根据权利要求14至17中任意一项所述的方法，其中所述步骤(c)
的细胞和/或所述步骤(e)的细胞群下述检测为阳性：
(i)至少一种选自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29的间充质

\t标记物；
(ii)至少一种选自HNF-3B、HNF-4、白蛋白、CYP1A2、CYP2C9、
CYP2E1和CYP3A4的肝脏标记物；
(iii)至少一种选自尿素分泌、胆红素缀合、α-1-抗胰蛋白酶分泌和
CYP3A4活性的肝脏特异性代谢活性；
(iv)含有蛋白2的Sushi结构域；和
(v)细胞角蛋白-19(CK-19)。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述步骤(c)的细胞和/或所
述步骤(e)的细胞群针对细胞角蛋白-18(CK-18)和/或α平滑肌肌动蛋白
(ASMA)的检测为阳性和针对CD140b的检测为阴性。
20.根据权利要求14至19中任意一项所述的方法，其中所述步骤(e)
的细胞群维持在允许在悬液中形成三维细胞簇的细胞培养条件中。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞群在低粘附容器或在
生物反应器中生产和维持。
22.根据权利要求14至21中任意一项所述的方法，其中所述方法还
包括步骤(f)，其中所述步骤(e)的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：E索卡尔，S斯奈克斯，T巴兰，K盖尔林克，
申请(专利权)人：普罗米迪拉生物科学公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE