使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞制造技术

本发明专利技术涉及干细胞向适于进一步分化为胰β细胞的均质内分泌祖细胞群的分化。本发明专利技术提供用于通过将前体细胞暴露于TGF-β I型受体抑制剂、BMP拮抗剂、腺苷酸环化酶激活剂和烟酰胺和/或将前体细胞暴露于选择的小分子获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从人多能干细胞例如人胚胎干细胞和诱导多能干细胞产生内分泌祖细胞的方法。专利技术背景β细胞移植潜在地提供了I型糖尿病的最终治疗。然而，供体β细胞有限的可用性制约了该治疗作为临床治疗的用途。多能干(PS)细胞可无限增殖和分化为多种细胞类型；因此，PS细胞为有希望的β细胞来源。然而，在PS细胞可用于治疗糖尿病前，其需要有效和可重复地分化为胰β细胞。在脊椎动物胚胎发育期间，多能细胞产生三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。对于形成内胚层衍生组织例如胰组织，定形内胚层(DE)的诱导是第一步。从DE细胞产生胰内胚层(PE)为产生产胰岛素的β细胞所必需的。具有成为内分泌祖细胞(EP)潜能的PE细胞特征在于两个重要转录因子PDX1和NKX6.1的共表达。对于从PS细胞产生胰细胞已经建立了分步体外分化方案。这些方案一般模拟胰发育的主要事件，其包括几个阶段例如DE、原肠、后前肠、PE、EP和最后完全分化的胰β细胞的形成。一些科学论文中描述的方案例示了用于从人胚胎干(hES)细胞和诱导多能干(iPS)细胞获得胰(-样)细胞的方案(Aoi等2008;D'Amour等2006;Jiang等2007;Kroon等2008;Takahashi等2007;Takahashi&Yamanaka2006；和Wernig等2007)。迄今为止，hES细胞的有效DE分化已通过激活蛋白A和Wnt处理实现。DE细胞可使用视黄酸(RA)(Cai等2010;D'Amour等2006)和BMP抑制剂(Kunisada等2012;Schulz等2012;Zhang等2009)进一步分化为PE细胞。在产生胰β细胞的途径中产生PE细胞之后的下一个步骤为产生表达NGN3和NKX2.2标志物的EP细胞。Nostro等(2012)和Kunisada等(2011)描述了用于将PE分化为EP的方法。然而，存在对更有效的将PE分化为EP的方法的需求。专利技术概述本专利技术提供改进的用于通过组合已知方案的特征从而增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞的百分比将胰内胚层(PE)分化为内分泌祖(EP)细胞的方法。通过向前述方法添加小分子所述百分比可进一步增加。小分子的某些组合允许NGN3/NKX2.2双阳性百分比的进一步有利增加。本专利技术进一步涉及通过本专利技术方法可获得的EP细胞。本专利技术进一步涉及所述细胞尤其在治疗I型糖尿病中的医学用途。本专利技术采用一种替代方法以改进人PE细胞向完全分化的β细胞分化的效率，即通过提供增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞(EP细胞定型为内分泌细胞命运的标志物)百分比的方法。在一个实施方案中，本专利技术提供改进的胰β细胞前体群，即，NGN3/NKX2.2双阳性细胞的百分比增加的EP细胞。在另一个实施方案中本专利技术提供更均质的EP细胞群，这对于这些细胞向完全分化的胰β细胞进一步发育是重要的。在另一个实施方案中，本专利技术还提供更同步的EP群，以到达分化的下一阶段，即葡萄糖响应的完全分化的β细胞。在一方面，本专利技术提供用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群暴露于基础培养基中的TGF-βI型受体抑制剂和BMP拮抗剂和腺苷酸环化酶激活剂和烟酰胺。在一方面，本专利技术提供用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群暴露于吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DAPT。本专利技术还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。附图简述图1显示本专利技术方法在NGN3mRNA诱导中的有利作用。图2显示本专利技术方法在产生NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞中的有利作用。图3显示组合本专利技术小分子的个体作用和有利作用。图4显示组合本专利技术几种小分子的个体作用和有利作用。专利技术详述本专利技术涉及从人源的多能干细胞例如胚胎干(ES)细胞和诱导多能干细胞产生内分泌祖(EP)细胞的方法。干细胞为通过其在单细胞水平自我更新且分化产生子代细胞(包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞)的能力而界定的未分化细胞。干细胞特征还在于其体外从多胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化为各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多胚层的组织的能力。干细胞按照其发育潜能分为：(1)全能的，意指能够产生所有胚胎和胚外细胞类型；(2)多能的(pluripotent)，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3)多潜能的(multi-potent)，意指能够产生细胞谱系的子集，但所有均在一种特定组织、器官或生理系统内(例如，造血干细胞可产生的子代包括HSC(自我更新)、血细胞限制的寡能的祖细胞和为血液正常组分的所有细胞类型和成分(例如，血小板))；(4)寡能的，意指能够产生比多潜能干细胞更受限的细胞谱系子集；和(5)单能的，意指能够产生单细胞谱系(例如，产生精子的干细胞)。成熟或分化的胰细胞的确不增殖而的确分泌高水平的胰内分泌激素或消化酶。例如，完全分化的β细胞响应葡萄糖而分泌高水平的胰岛素。当细胞丧失未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，出现细胞相互作用变化和成熟。丧失或获得单个标志物可指示细胞已经“成熟或完全分化”。本专利技术采用一种替代方法以改进人PE细胞向完全分化的β细胞分化的效率，即通过提供增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞百分比的方法，所述NGN3/NKX2.2为EP细胞群的标志物，所述EP细胞群是到达产胰岛素胰β细胞所必需的细胞阶段之一。此外，本专利技术提供更均质和同步的EP细胞群，这对于这些细胞向产胰岛素的β细胞进一步发育是重要的。本专利技术还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。如本文所使用的，“产胰岛素细胞”指响应葡萄糖产生和储存或分泌可检测量的胰岛素的细胞。“产胰岛素细胞”可为单个细胞或细胞集合。如本文所使用的术语“β细胞”指位于胰内称为胰岛的小细胞簇中的细胞。β细胞通过分泌肽激素胰岛素响应高血糖水平，所述肽激素胰岛素作用于其它组织以促进从血液吸收葡萄糖，例如在肝脏中，其中其促进能量经由糖原合成而储存。如本文所使用的“分化(differentiate)”或分化“(differentiation)”指细胞从未分化状态发展至分化状态，从不成熟状态发展至较不成熟状态或从不成熟状态发展至成熟状态的过程。例如，早期未分化的胚胎胰细胞能够增殖和表达特征标志物，如PDX1、NKX6.1和PTF1a。术语“分化因子”指加至ES-或胰前体细胞以促进其分化为EP细胞的化合物。分化因子还可驱使进一步分化为成熟β细胞。示例性的分化因子包括肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、毒蜥外泌肽(exendin)-4、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、神经生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰高血糖素样肽1、吲哚内酰胺V（indolactamV）、IDE1&本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群同时暴露于基础培养基中的：a) TGF‑β I型受体抑制剂，b) BMP拮抗剂，其中所述BMP拮抗剂为头蛋白（noggin），c) 腺苷酸环化酶激活剂，和d) 烟酰胺。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.30 EP 13182440.1;2013.09.09 US 61/8751911.用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群同时暴露于基础培养基中的：
a)TGF-βI型受体抑制剂，
b)BMP拮抗剂，其中所述BMP拮抗剂为头蛋白（noggin），
c)腺苷酸环化酶激活剂，和
d)烟酰胺。
2.权利要求1的方法，其中所述TGF-βI型受体抑制剂为SB431542。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯扣林(forskolin)。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述内分泌祖细胞为至少8%效果NGN3/NKX2.2双阳性。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述内分泌祖细胞为至少10%效果NGN3/NKX2.2双阳性。
6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述内分泌祖细胞为10-100%效果NGN3/NKX2.2双阳性。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述基础培...

【专利技术属性】
技术研发人员：U多恩，NS克里斯托赫森，J埃克伯格，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，宝生物工程欧洲股份公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK