形成类肾体的多能干细胞的分化制造技术

提供一种用于产生类肾体的方法，所述类肾体包含肾单位、输尿管芽和血管系统和/或这些的祖细胞。在一个实施方案中，所述方法包括在促进血管化类肾体形成的条件下使中段中胚层细胞与以下接触：成纤维细胞生长因子9和/或成纤维细胞生长因子20和/或成纤维细胞生长因子2，任选地选自由以下组成的组的一种或多种物质：骨形态发生蛋白7；肝素；Wnt激动剂；视黄酸；和RA拮抗剂。另一实施方案包括通过使多能干细胞与Wnt激动剂和成纤维细胞生长因子9和/或成纤维细胞生长因子20和/或成纤维细胞生长因子2顺序接触，接着相对短的再次暴露于Wnt激动剂，来产生中胚层细胞。类肾体可具有这样的最终用途，例如用于肾脏修复和再生，肾脏或其功能组分的生物打印，肾细胞阵列和筛选肾毒性的化合物。

Differentiation of multipotent stem cells from the renal body

A method is provided for producing a renal body comprising a nephron, a ureteric bud and a vascular system, and / or these progenitor cells. In one embodiment, the method includes the following contact in the intermediate mesoderm cells and promote vascularization of kidney body formed under the conditions: fibroblast growth factor 9 and / or fibroblast growth factor 20 and / or fibroblast growth factor 2, optionally selected by one or more the material under the group consisting of: bone morphogenetic protein 7; heparin; Wnt agonists; retinoic acid; and RA antagonists. Another embodiment includes the pluripotent stem cells with Wnt agonists and 9 fibroblast and / or fibroblast growth factor 20 and / or fibroblast growth factor 2 in order to contact growth factor, then a relatively short re exposure to the Wnt agonist, to produce mesoderm cells. The kidney like body can have such end uses, such as for renal repair and regeneration, for renal or functional components of biological prints, for renal cell arrays and for screening nephrotoxicity compounds.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】形成类肾体的多能干细胞的分化
本专利技术涉及肾发育。更具体地说，本专利技术涉及产生类肾体的体外方法，其包括肾单位和/或输尿管芽和/或这些的祖细胞，其至少部分血管化并含有肾间质区室。
技术介绍
在终末期肾病的流行率全球每年上升8％的情况下，迫切需要肾再生策略。肾脏是通过输尿管芽(uretericbud,UB)的形成以及该芽与相邻中段中胚层(intermediatemesoderm,IM)来源的后肾间充质(metanephricmesenchyme,MM)之间的相互作用而从IM分化的中胚层器官。肾单位来自源于MM的肾单位祖细胞群。IM或MM中的其他祖细胞被认为有助于肾基质/间质和包括肾小球毛细血管在内的肾血管系统的组分。IM本身源于后原条(posteriorprimitivestreak)。尽管非常了解肾脏的发育起源，人肾中的肾单位形成在出生前已经完成5。因此，没有能够替代丢失的肾单位的出生后的干细胞。人多能干细胞对于产生用于肾病的基于细胞的治疗具有巨大的潜力。然而，人多能干细胞作为临床使用的细胞来源以及作为诸如肾病等的治疗的实现已经因缺乏对如何制备产生肾单位和肾的其它结构所必需的细胞类型的理解而受到阻碍。
技术实现思路
本专利技术人使用正常胚胎发生期间使用的生长因子，在完全化学限定的单层培养条件下成功地引导人多能干细胞通过后原条和中段中胚层(IM)的分化。该分化方案导致输尿管芽(UB)和后肾间充质(MM)的同步诱导，所述同步诱导在体外形成自组织结构，包括肾单位形成和分段，以形成远端小管、近端小管和鲍曼氏囊。类器官还含有间充质源性肾基质。这种hESC来源的组分显示出广泛的离体肾潜能，说明了基于多能干细胞的肾再生的潜力。此外，本专利技术人已经引导类肾体内的血管系统分化，包括分化的输尿管芽(UB)、后肾间充质(MM)和MM来源的肾单位和基质。在特定形式中，本专利技术提供在缩短的培养期内形成类肾体的聚集的肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的生成。更具体地，本专利技术提供一种用于引导人多能干细胞形成复合多细胞类肾体的方法，所述复合多细胞类肾体包含由内皮和肾间质包围的完全分段的肾单位，并且与人胎肾转录相似。因此，本专利技术的一个方面提供一种生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，所述方法包括使中段中胚层(IM)细胞与以下接触的步骤：成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)和/或成纤维细胞生长因子2(FGF2)；和任选选自由：骨形态发生蛋白7(BMP7)；肝素；Wnt激动剂；视黄酸(RA)，类似物或激动剂；和RA拮抗剂组成的组的一种或多种剂；从而在诱导或促进肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞聚集成一个或多个类肾体的条件下由IM细胞产生肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞，由此类肾体至少部分血管化和/或包含血管祖细胞。在一些实施方案中，通过促进或引导来自间充质细胞或组织的血管内皮或血管祖细胞的发育的条件来促进至少部分血管化和/或血管祖细胞的存在。在一个实施方案中，通过包含一种或多种人多能干细胞和/或由其分化的血管内皮祖细胞来促进类肾体的血管形成。在另一个实施方案中，通过使用促进血管形成的合适的氧分压(oxygentension)来促进类肾体细胞的血管化。在一个实施方案中，IM细胞衍生自或分化自后原条细胞。在一个实施方案中，后原条细胞衍生自或分化自人多能干细胞(hPSC)。hPSC的非限制性实例包括人胚胎干细胞(hESC)和诱导的人多能干细胞(iPSC)。本专利技术的相关方面提供一种产生中胚层细胞的方法，所述方法包括以下步骤：使hPSC与Wnt激动剂接触，从而产生中胚层细胞。中胚层细胞可以是中胚层细胞例如定形中胚层(definitivemesoderm)和包括喙部IM和/或尾部IM的中段中胚层(IM)的混合群体。该方法可以进一步包括使定形中胚层细胞与成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)和/或成纤维细胞生长因子2(FGF2)接触的后续步骤。适当地，使定形中胚层细胞与成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)和/或成纤维细胞生长因子2(FGF2)接触的后续步骤有助于形成中段中胚层(IM)，其随后产生来自IM细胞的输尿管上皮细胞和肾单位祖细胞的分化。在另一个实施方案中，该方法还包括将细胞解离并再聚集成细胞团用于在FGF2、FGF9和/或FGF20的存在下培养的后续步骤。适当地，该步骤有利于生产包含肾单位的类肾体。在FGF2、FGF9和/或FGF20的存在下的培养可以在空气/培养基界面处的浮动过滤器上进行。在另一个实施方案中，所述方法还包括在除去FGF2、FGF9和/或FGF20之前添加Wnt激动剂，并且随后在没有生长因子的情况下培养。该步骤进一步促进类肾体内肾单位的形成。适当地，在相对短的时间内(如30-60分钟)Wnt激动剂处在相对较高的浓度下。任选地，在任何上述步骤中在Wnt激动剂、成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)和/或成纤维细胞生长因子2(FGF2)的存在下培养细胞还可以包括以下的一种或多种：视黄酸(RA)拮抗剂，RA或RA激动剂，骨形态发生蛋白7(BMP7)；和/或视黄酸。优选地，类肾体至少部分血管化。优选地，类肾体包括由内皮、血管周围细胞和肾间质包围的分段的肾单位。在一个实施方案中，通过包含一种或多种人多能干细胞和/或由其分化的血管内皮祖细胞来促进类肾体的血管化。在另一个实施方案中，通过使用促进血管化的合适的氧分压来促进类肾体的血管化。在一个实施方案中，该方法还包括鉴定活的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞的步骤。在某些实施方案中，活的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞的鉴定包括作为活的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞的标志物的多种核酸和/或蛋白质的共表达的测定或检测。另一方面，本专利技术提供根据前述方面的方法产生的分离的、富集的或纯化的肾单位和/或输尿管上皮祖细胞和/或类肾体。优选地，类肾体包括由内皮和肾间质包围的分段的肾单位。还在另一方面，本专利技术提供了一种产生肾或者肾细胞或组织的方法，所述方法包括由前述方面的肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞和/或类肾体分化肾或者肾细胞或组织的步骤，由此产生肾或者肾细胞或组织。在一些实施方案中，肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞和/或类肾体可用于全器官脱细胞肾的再细胞化，从而产生重构或替代的肾。在其他实施方案中，肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞和/或类肾体可用作肾脏疾病和病况的细胞疗法的来源。在某些方面，肾单位祖细胞和/或输尿管上皮祖细胞和/或类肾体可用作用于生物打印或生物工程全肾的细胞或组织的来源、用于肾移植或治疗慢性肾损害或疾病的肾细胞和/或组织的来源。一个特定方面提供一种生物打印肾结构的方法，所述方法包括沉积本文公开的多个hPSC或其它祖细胞以形成肾结构，所述肾结构具有肾或其组分的一种或多种功能特征，或者其能够显现肾或其组分的一种或多种功能特征。适当地，所述肾结构至少部分血管化和/或包含血管祖细胞。适当地，hPSC或其它祖细胞经受本文公开的方法用于产生三维结构中的肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞。该特定方面还提供生物打印的肾结构，其具有肾或其组分的一种或多种功能特征，或能本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，所述方法包括使中段中胚层(IM)细胞与以下接触：成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)和/或成纤维细胞生长因子2(FGF2)；任选地选自由：骨形态发生蛋白7(BMP7)；肝素；Wnt激动剂；视黄酸(RA)，类似物或激动剂；和RA拮抗剂组成的组的一种或多种；从而在诱导肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞聚集成一个或多个类肾体的条件下产生肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞，由此类肾体至少部分血管化和/或包含血管祖细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.12.15 AU 20142776671.一种生产肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞的方法，所述方法包括使中段中胚层(IM)细胞与以下接触：成纤维细胞生长因子9(FGF9)和/或成纤维细胞生长因子20(FGF20)和/或成纤维细胞生长因子2(FGF2)；任选地选自由：骨形态发生蛋白7(BMP7)；肝素；Wnt激动剂；视黄酸(RA)，类似物或激动剂；和RA拮抗剂组成的组的一种或多种；从而在诱导肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞聚集成一个或多个类肾体的条件下产生肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞，由此类肾体至少部分血管化和/或包含血管祖细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中通过促进或引导血管内皮或血管祖细胞从间充质细胞或组织发育的条件来促进血管形成。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中FGF9和/或FGF20和/或FGF2的浓度选自由以下组成的组：约20ng至1μg/mL的范围内；约50-500ng/mL的范围内；约100-300ng/mL的范围内；和约200ng/mL。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中BMP7以选自由以下组成的组的浓度存在：约25至75ng/mL的范围内；约35至60ng/mL的范围内；约45至55ng/mL的范围内；和约50ng/mL。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中RA、类似物或激动剂增加来自IM细胞的输尿管上皮祖细胞的相对产生。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中RA、类似物或激动剂以选自由以下组成的组的浓度存在：约10pM至1μM的范围内；约30pM至0.5μM的范围内；约50pM至0.2μM的范围内；约0.1μM。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RA拮抗剂增加来自IM细胞的肾单位祖细胞的相对产生。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RA拮抗剂以选自由以下组成的组的浓度存在：约0.50pM至10μM范围内；约0.01μM至5μM的范围内；约0.1μM至5μM的范围内；和约1μM。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Wnt激动剂增加来自所述IM细胞的肾单位祖细胞的相对产生。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Wnt激动剂以选自由以下组成的组的浓度存在：约0.1μM至10μM的范围内；约0.2μM至5μM的范围内；和约1-2μM的范围内。11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中肝素以约0.1-10μg/mL的浓度存在。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述中段中胚层(IM)细胞与FGF9单独接触或与FGF9同BMP7、RA、RA拮抗剂、Wnt激动剂、FGF20、FGF2和/或肝素中的一种或多种的组合接触约72-360小时。13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肾单位祖细胞和输尿管上皮祖细胞是从所述IM细胞同步或同时产生的。14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括使后原条细胞与促进所述后原条细胞分化成所述IM细胞的一种或多种试剂接触。15.根据权利要求13所述的方法，其包括使人多能干细胞(hPSC)与促进hPSC分化成所述后原条细胞的一种或多种试剂接触。16.一种产生中胚层细胞的方法，所述方法包括使hPSC与Wnt激动剂接触从而产生中胚层细胞的步骤。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述中胚层细胞是包含定形中胚层和中段中胚层中的一种或多种的混合群体。18.根据权利要求15或16所述的方法，其中Wnt激动剂的浓度为约8μM。19.根据权利要求15、16或17所述的方法，其中所述hPSC与Wnt激动剂接触约4天。20.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述中胚层细胞随后与FGF9和/或FGF20和/或FGF2接触约3天。21.根据权利要求19所述的方法，其还包括使所述细胞与Wnt激动剂接触的后续步骤。...

【专利技术属性】
技术研发人员：高里实，梅利莎·利特尔，
申请(专利权)人：昆士兰大学，
类型：发明
国别省市：澳大利亚,AU