培养的哺乳动物角膜缘干细胞、其产生方法和其用途技术

本发明专利技术提供分离的角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)群体或LSC样群体和其用途，所述群体包含化学合成、重组或分离的编码PAX6的核酸，所述核酸整合到染色体中，或者未整合而保持为染色体外遗传材料，其中所述分离的LSC群体基本上不含非LSC细胞，或其中所述LSC样群体基本上不含非LSC样细胞，或其中所述分离的LSC或LSC样群体基本上不含非LSC和非LSC样细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】培养的哺乳动物角膜缘干细胞、其产生方法和其用途本申请要求2014年6月27日提交的美国临时申请号62/018,396的权益，该美国临时申请以引用方式整体并入本文中。在本申请中引用各种出版物。这些出版物的全部公开内容在此通过引用并入本申请中以更全面地描述本专利技术所属现有技术的状况。
本专利技术的领域涉及用于治疗眼科病症、疾病和损伤的方法和组合物。具体地说，本专利技术的领域涉及用于治疗角膜和眼部表面的病症、疾病、缺陷和损伤的方法、试剂盒和组合物。本公开涉及来源于角膜缘组织的培养的哺乳动物角膜缘干细胞的制剂。在优选的实施方案中，角膜缘干细胞系是自我更新的并且具有分化为角膜上皮组织的能力。还公开了用于培养角膜缘干细胞系的方法以及它们的使用的方法和组合物。
技术介绍
已知成体干细胞存在于眼的角巩膜缘中。这些细胞参与角膜表面的动态平衡并取代在眨眼期间蜕下并脱落的浅表上皮细胞。来自化学或热灼伤、接触透镜、若干微生物感染、多次手术程序、冷冻疗法或疾病如史蒂文-约翰逊综合征(Steven-Johnsonsyndrome)或眼部瘢痕类天疱疮对角膜缘干细胞的若干损伤可导致角膜缘干细胞的破坏和角膜缘干细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)群体或LSC样群体，其包含化学合成、重组或分离的编码PAX6的核酸，所述核酸整合到染色体中，或者未整合而保持为染色体外遗传材料，其中所述分离的LSC群体基本上不含非LSC细胞，或其中所述LSC样群体基本上不含非LSC样细胞，或其中所述分离的LSC或LSC样群体基本上不含非LSC和非LSC样细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.27 US 62/018,3961.一种分离的角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)群体或LSC样群体，其包含化学合成、重组或分离的编码PAX6的核酸，所述核酸整合到染色体中，或者未整合而保持为染色体外遗传材料，其中所述分离的LSC群体基本上不含非LSC细胞，或其中所述LSC样群体基本上不含非LSC样细胞，或其中所述分离的LSC或LSC样群体基本上不含非LSC和非LSC样细胞。2.根据权利要求1所述的分离的LSC群体或LSC样群体，其中所述化学合成、重组或分离的核酸可表达PAX6或其片段，其中PAX6或其片段可维持LSC状态或LSC样状态或可将干细胞或祖细胞引导至LSC状态或LSC样状态，并且其中LSC状态或LSC样状态将细胞群体限定于产生角膜上皮细胞(CEC)的分化途径。3.根据权利要求2所述的分离的LSC群体或LSC样群体，其中所述化学合成、重组或分离的核酸表达PAX6或其片段，其中PAX6或其片段可维持LSC状态或LSC样状态或将干细胞或祖细胞引导至LSC状态或LSC样状态，并且其中LSC状态或LSC样状态将细胞群体限定为产生角膜上皮细胞的分化途径。4.一种分离的皮肤上皮干细胞(SESC)群体或SESC样群体，其包含化学合成、重组或分离的编码PAX6的核酸，所述核酸整合到染色体中，或者未整合而维持为染色体外遗传材料，其中所述分离的SESC群体基本上不含非SESC细胞，或其中所述SESC样群体基本上不含非SESC样细胞，或其中所述分离的SESC群体或SESC样群体基本上不含非SESC细胞和非SESC样细胞，或其中所述分离的SESC群体或SESC样群体基本上不含非SESC细胞、非SESC样细胞、非LSC细胞和非LSC样细胞。5.根据权利要求4所述的分离的SESC群体或SESC样群体，其中所述化学合成、重组或分离的核酸可表达PAX6或其片段，其中PAX6或其片段可维持LSC状态或LSC样状态或可将干细胞或祖细胞引导至LSC状态或LSC样状态，并且其中LSC状态或LSC样状态将细胞群体限定为产生角膜上皮细胞的分化途径。6.根据权利要求5所述的分离的SESC群体或SESC样群体，其中所述化学合成、重组或分离的核酸表达PAX6或其片段，其中PAX6或其片段将SESC细胞或SESC样细胞引导至LSC状态或LSC样状态，其中LSC状态或LSC样状态将细胞群体限定为产生角膜上皮细胞的分化途径。7.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体和适合的载体。8.一种药物组合物，其包含根据权利要求4所述的SESC群体或SESC样群体和适合的载体。9.根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体，其可被培养至少17次传代而不分化为CEC。10.根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体，其中在第3次传代时表达PAX6和p63的细胞的百分比与第17次传代时的百分比相同。11.根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体，其中在第3次传代时表达K19和Ki67的细胞的百分比略大于第17次或第17次以后传代时的百分比。12.根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体，其包含可稳定繁殖40-60代而不分化为CEC的细胞。13.根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体，其分化为角膜上皮细胞群体。14.根据权利要求4所述的SESC群体或SESC样群体，其可被培养至少17次传代而不分化为皮肤表皮细胞或角膜上皮细胞。15.根据权利要求4所述的SESC群体或SESC样群体，其包含可稳定繁殖40-60代而不分化为皮肤表皮细胞或角膜上皮细胞的细胞。16.根据权利要求4所述的SESC群体或SESC样群体，其包含已将细胞命运转变为LSC或LSC样细胞命运的SESC细胞或SESC样细胞。17.根据权利要求16所述的SESC群体或SESC样群体，其中所述SESC群体或SESC样群体已采用LSC或LSC样细胞命运，并且其中不存在所述SESC或SESC样细胞命运。18.根据权利要求4、16或17所述的SESC群体或SESC样群体，其分化为角膜上皮细胞。19.根据权利要求18所述的SESC群体或SESC样群体，其分化为基本上不含皮肤表皮细胞的角膜上皮细胞。20.根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体，其中90-95％的所述LSC群体或LSC样群体表达p63、PAX6、K19和Ki67。21.根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体，其中小于5％的所述LSC群体表达K5和K14。22.根据权利要求1所述的LSC群体，其中大于95％的所述LSC群体表达WNT7A和FZD5。23.根据权利要求1所述的LSC样群体，其中小于5％的所述LSC样群体表达WNT7A。24.根据权利要求4所述的SESC群体或SESC样群体，其中90-95％的所述细胞群体表达p63、K5和Ki67，同时保持为SESC或SESC样细胞命运。25.根据权利要求4所述的SESC群体或SESC样群体，其中在保持为SESC或SESC样细胞命运的细胞中未检测到K3或K12表达。26.根据权利要求4所述的SESC群体，其中WNT7A在保持为SESC或SESC样细胞命运的细胞中以在LSC细胞中的水平的约1/5-1/4的水平表达。27.根据权利要求4所述的SESC群体或SESC样群体，其中PAX6在保持为SESC或SESC样细胞命运的细胞中不表达或以小于LSC细胞中的水平的约1/8的水平表达。28.根据权利要求4所述的SESC样群体，其中WNT7A在大于70％的保持为SESC样命运的细胞中表达。29.根据权利要求16所述的SESC群体或SESC样群体，其中所述群体中90-95％转变为LSC或LSC样细胞命运的细胞表达p63、PAX6、K19和Ki67。30.根据权利要求2或18所述的LSC群体或LSC样群体，其中所述角膜上皮细胞表达PAX6和角膜上皮标志物K3和K12。31.根据权利要求19所述的SESC群体或SESC样群体，其中所述皮肤表皮细胞表达皮肤表皮分化标志物K1和K10。32.根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体，其为人。33.根据权利要求4所述的SESC群体或SESC样群体，其为人。34.根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体，其经遗传改良。35.根据权利要求4所述的SESC群体或SESC样群体，其经遗传改良。36.根据权利要求1所述的LSC群体或LSC样群体，其保持或维持为LSC或LSC样细胞命运。37.根据权利要求4所述的SESC群体或SESC样群体，其从SESC或SESC样细胞命运转变为LSC或LSC样细胞命运。38.一种限定的细胞群体，其包含根据权利要求1或4所述的多个细胞。39.根据权利要求38所述的限定的细胞群体，其是同源的。40.根据权利要求38所述的限定的细胞群体，其是异源的。41.根据权利要求38所述的限定的细胞群体，其是克隆的或来源于单细胞。42.一种根据权利要求38所述的干细胞的后代细胞，其致力于发育为角膜上皮细胞。43.组织，其包含根据权利要求38所述的细胞。44.一种形成受试者的组织的方法，其包括将足够量的根据权利要求42所述的后代细胞引入受试者之中或引入受试者之上以形成所述受试者的角膜上皮细胞。45.一种使受试者的组织再生或修复的方法，其包括将足够量的根据权利要求1或4所述的细胞引入受试者之中或引入受试者之上以使组织再生或修复。46.根据权利要求45所述的方法，其中所再生或修复的组织包括角膜上皮细胞谱系的组织，所述角膜上皮细胞谱系包含角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)和角膜上皮细胞。47.一种用于从受试者的皮肤上皮干细胞(SESC)获得角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)样细胞的方法，所述方法包括在SESC中引入PAX6基因或上调PAX6基因表达，以使SESC中的PAX6蛋白质增加到足以使SESC转化为LSC样细胞的水平，从而从受试者的SESC获得LSC样细胞。48.根据权利要求47所述的方法，其中为了从受试者的皮肤上皮干细胞(SESC)获得角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)样细胞在SESC中引入PAX6基因或上调PAX6基因表达，方法包括：(a)从所述受试者获得SESC；(b)在无饲养层的细胞培养基中体外或离体培养所述SESC；(c)在所述SESC中引入至少一种PAX6基因或上调PAX6基因表达，以使SESC中的PAX6蛋白质增加到足以使SESC转化为角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)样细胞的水平，从而从来自受试者的皮肤上皮干细胞(SESC)获得哺乳动物角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)样细胞。49.根据权利要求47所述的方法，其中所述方法是体外方法、离体方法或原位或直接施加于受试者。50.根据权利要求47所述的方法，其中用引入编码PAX6蛋白质的核酸的试剂、上调PAX6基因表达的试剂或增加PAX6活性的试剂治疗所述受试者。51.根据权利要求47所述的方法，其中所述试剂包括基因治疗载体、病毒粒子、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、重组核酸、重组蛋白质、PAX6蛋白质、PAX6表达的小分子调节物、PAX6表达的负调节物的抑制剂、PAX活性的负调节物的小分子抑制剂、PAX6活性的小分子增强剂或其组合。52.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述PAX6基因选自以下的组：PAX6a基因、PAX6b基因、工程化的PAX6a基因、工程化的PAXb基因、PAX6基因家族的任何成员、编码整个或部分PAX6a蛋白质的核酸、编码整个或部分PAX6b蛋白质的核酸和编码具有PAX6或PAX6样活性的蛋白质的任何核酸。53.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述PAX6蛋白质选自以下的组：PAX6a蛋白质、PAX6b蛋白质、PAX6蛋白质家族的任何成员和具有PAX6或PAX6样活性的任何蛋白质。54.根据权利要求52或53所述的方法，其中具有PAX6或PAX6样活性的蛋白质是可引起内源性K19表达增加的任何蛋白质，其中K19上调的SECS可分化为K3和K12基因表达增加且K1和K10基因表达降低的角膜上皮细胞(CEC)或CEC样细胞。55.一种用于从根据权利要求48所述的LSC样细胞获得角膜上皮细胞(CEC)样细胞的方法，其进一步包括在无饲养层的LSC分化培养基中分化(c)的细胞，以使LSC样细胞转化为CEC样细胞。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述无饲养层的LSC分化培养基是化学成分确定的。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述培养基不含异源物或不含除来源于与所培养的细胞相同的物种的组分之外的组分。58.根据权利要求56所述的方法，其中所述培养基不含血清。59.根据权利要求56所述的方法，其中所述培养基没有任何动物产物或人产物。60.一种用于从皮肤上皮干细胞(SESC)获得角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)样细胞的方法，其包括以下步骤：(a)从受试者获得SESC；(b)在无饲养层的细胞培养基中体外培养所述SESC；(c)使所述SESC与上调所述SESC中的PAX6基因表达的试剂接触，以使SESC中的PAX6蛋白质增加到足以使SESC转化为角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)样细胞的水平，从而从来自受试者的皮肤上皮干细胞(SESC)获得哺乳动物角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)样细胞。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述试剂选自由以下组成的组：包含PAX6基因的核酸、基因治疗载体、病毒粒子、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、重组蛋白质、PAX6蛋白质、PAX6表达的小分子调节物、PAX6表达的负调节物的抑制剂、PAX活性的负调节物的小分子抑制剂、PAX6活性的小分子增强剂和其组合。62.根据权利要求61所述的方法，其中所述PAX6基因选自以下的组：PAX6a基因、PAX6b基因、工程化的PAX6a基因、工程化的PAXb基因、PAX6基因家族的任何成员、编码整个或部分PAX6a蛋白质的核酸、编码整个或部分PAX6b蛋白质的核酸和编码具有PAX6或PAX6样活性的蛋白质的任何核酸。63.根据权利要求61所述的方法，其中所述PAX6蛋白质选自以下的组：PAX6a蛋白质、PAX6b蛋白质、PAX6蛋白质家族的任何成员和具有PAX6或PAX6样活性的任何蛋白质和其片段。64.一种用于从受试者获得哺乳动物LSC的体外方法，其包括以下步骤：(a)从来自所述受试者的眼的边缘区域获得组织的样品；(b)将所述组织解离以获得单细胞；和(c)在无饲养层的细胞培养基中培养(b)的单细胞以允许LSC增殖，其中所增殖的LSC具有分化为角膜上皮细胞(CEC)的潜力，从而从受试者体外获得哺乳动物LSC。65.根据权利要求64所述的方法，其中所述边缘区域包括眼的角膜缘。66.根据权利要求64所述的方法，其中在(b)中解离所述组织包括用一种或多种解离剂处理，其中所述一种或多种解离剂是将组织机械解离为更小的团块和单细胞的设备或工具、酶、蛋白酶、化学品、金属螯合剂、激光或其组合。67.根据权利要求60或64所述的方法，其中所述无饲养层的细胞培养基进一步包含Rho相关蛋白质激酶(ROCK)抑制剂或白血病抑制因子(LIF)或两者。68.根据权利要求67所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632(4-[(1R)-1-氨乙基]-N-4-吡啶基-反式-环己烷甲酰胺二盐酸盐)。69.根据权利要求60或64所述的方法，其进一步包括通过在基质或细胞外基质上培养而将所述LSC细胞或LSC样细胞转化为CEC样细胞的步骤。70.一种用于在无饲养层的LSC培养基中从受试者体外获得并扩增哺乳动物角膜缘干细胞或祖细胞(LSC)的方法，其中所述方法包括：(a)从来自所述受试者的眼的边缘区域获得组织的样品；(b)将所述组织解离以获得单细胞；和(c)在无饲养层的细胞培养基中培养(b)的单细胞以允许LSC增殖，其中所增殖的LSC具有分化为角膜上皮细胞(CEC)的潜力，从而从受试者体外获得并扩增哺乳动物角膜缘干细胞。71.根据权利要求48或70所述的方法，其中在(c)中，在基质或细胞外基质上培养单细胞。72.根据权利要求71所述的方法，其中所述基质或细胞外基质选自由以下组成的组：或其等同物、减少生长因子的或其等同物、胶原、胶原IV、胶原IV片、哺乳动物羊膜、人羊膜、纤维蛋白原、凝血酶、基底膜蛋白多糖、层粘连蛋白、纤连蛋白、重组纤连蛋白、蛋白聚糖、前胶原、透明质酸、巢蛋白、硫酸乙酰肝素、腱糖蛋白、聚-L-赖氨酸、明胶、聚-L-鸟氨酸、细胞外基质蛋白质、凝血酶片、纤维蛋白原和凝血酶片以及其任何组合。73.根据权利要求70所述的方法，其进一步包括步骤(d)，其中所增殖的LSC细胞或LSC样细胞在传代前70-90％汇合时被传代以及传代后15-20％汇合时被传代。74.根据权利要求73所述的方法，其中所增殖的LSC细胞或LSC样细胞可作为LSC细胞或LSC样细胞稳定传代的次数是17次或更多次传代。75.根据权利要求73所述的方法，其中所述LSC以约16-20小时的世代时间增殖。76.根据权利要求73所述的方法，其中所述LSC细胞或LSC样细胞稳定繁殖40-60代而不分化为CEC。77.根据权利要求70所述的方法，其中每隔一天更换所述无饲养层的LSC培养基。78.根据权利要求70所述的方法，其中所述边缘区域包含眼的角膜缘、角膜和结膜之间的边缘、角膜和巩膜之间的边界、角巩膜缘、包含栅间表皮突的区域或包含Vogt栅状皱纹的区域。79.根据权利要求70所述的方法，其中在(b)中解离所述组织包括用一种或多种解离剂处理，其中所述一种或多种解离剂是将组织机械解离为更小的团块和单细胞的设备或工具、酶、蛋白酶、化学品、金属螯合剂、激光或其组合。80.根据权利要求79所述的方法，其中所述蛋白酶包括胰蛋白酶、胶原酶IV或其组合。81.根据权利要求79所述的方法，其中所述金属螯合剂包括EDTA、EGTA或其组合。82.根据权利要求70所述的方法，其中所述无饲养层的细胞培养基包含最低必需培养基、生长因子、激素和可溶性因子。83.根据权利要求82所述的方法，其中所述无饲养层的细胞培养基进一步包含血清，优选来自获得且扩增所述LSC的物种的血清，或血清代用品。84.根据权利要求82所述的方法，其中所述无饲养层的细胞培养基进一步包含Rho相关蛋白质激酶(ROCK)抑制剂。85.根据权利要求84所述的方法，其中所述ROCK抑制剂选自由以下组成的组：(R)-(+)-反式-4-(1-氨乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物(Y-27632)；5-(1,4-二氮杂环庚烷-1-基磺酰基)异喹啉(法舒地尔或HA1077)；H-1152；H-1152P；(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]高哌嗪二盐酸盐；二甲基法舒地尔(diMF；H-1152P)；N-(4-吡啶基)-N′-(2,4,6-三氯苯基)脲；Y-39983；Wf-536；SNJ-1656和(S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1,4-二氮杂二盐酸盐(H-1152)；含咪唑的苯二氮杂咪唑并吡啶衍生物；包含吲唑核、2-氨基吡啶/嘧啶核、9-脱氮鸟嘌呤衍生物、苯甲酰胺或氨基呋咱的化合物以及其衍生物和类似物；和其组合。86.根据权利要求84所述的方法，其中在从所述受试者分离LSC后，在LSC第四(4)次传代后，将所述ROCK抑制剂添加到所述无饲养层的细胞培养基中。87.根据权利要求82所述的方法，其中所述无饲养层的细胞培养基进一步包含白血病抑制因子(LIF)。88.根据权利要求87所述的方法，其中在从所述受试者分离LSC后，在LSC第四(4)次传代后，将LIF添加到所述无饲养层的细胞培养基中。89.根据权利要求70所述的方法，其中所述无饲养层的细胞培养基包含DMEM/F12培养基、DMEM、青霉素-链霉素、血清、EGF、胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素、3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸或其组合，其中血清可以是胎牛血清，但优选来自与培养的LSC相同的物种的血清，或血清代用品。90.根据权利要求70所述的方法，其中所述无饲养层的细胞培养基包含DMEM/F12培养基、DMEM、青霉素-链霉素、血清、EGF、胰岛素、氢化可的松、霍乱毒素和3,3’,5-三碘-L-甲状腺原氨酸，其中血清可以是胎牛血清，但优选来自与培养的LSC相同的物种的血清，或血清代用品。91.根据权利要求89或90所述的方法，其中所述无饲养层的细胞培养基进一步包含ROCK抑制剂Y-27632。92.根据权利要求91所述的方法，其中在第4次细胞传代后将所述ROCK抑制剂Y-27632添加到所述无饲养层的细胞培养基中。93.根据权利要求89或90所述的方法，其中所述无饲养层的细胞培养基进一步包含白血病抑制因子(LIF)。94.根据权利要求93所述的方法，其中在从所述受试者分离LSC后，在LSC第四(4)次传代后，将LIF添加到所述无饲养层的细胞培养基中。95.根据权利要求70所述的方法，其中LSC表达一组标志物，所述组标志物包括WNT7A、FZD5、PAX6、p63、角蛋白5(K5)、角蛋白14(K14)、角蛋白19(K19)和Ki67。96.根据权利要求70所述的方法，其中90-95％的所述LSC表达p63、PAX6、K19和Ki67。97.根据权利要求70所述的方法，其中小于5％的所述LSC表达K5和K14。98.根据权利要求70所述的方法，其中大于95％的所述LSC表达WNT7A和FZD5。99.根据权利要求70所述的方法，其中CEC表达一组标志物，所述组标志物包括WNT7A、FZD5、PAX6、角蛋白3(K3)和角蛋白12(K12)，其相对于LSC，具有统计学上显著更高的K3和K12表达，并且相对于LSC，具有统计学上显著更低的K19表达。100.根据权利要求70所述的方法，其中CEC不表达p63或相比于LSC表达显著更低水平的p63，并且不表达角蛋白1(K1)和角蛋白10(K10)或相比于皮肤或表皮细胞表达显著更低水平的角蛋白1(K1)和角蛋白10(K10)。101.一种用于使分离的LSC体外分化为角膜上皮细胞(CEC)的方法，其包括：(a)获得最初来源于受试者的先前培养的LSC，其优选被解离为单细胞状态；(b)将分离的LSC置于基质或细胞外基质之中和/或基质或细胞外基质之上以形成或允许形成适于分化的三维细胞培养物；和(c)在LSC分化培养基中培养LSC以允许分离的LSC体外分化为CEC，从而使分离的LSC体外分化为角膜上皮细胞。102.根据权利要求101所述的方法，其中所述基质或细胞外基质选自由以下组成的组：或其等同物、减少生长因子的或其等同物、胶原、胶原IV、胶原IV片、哺乳动物羊膜、人羊膜、纤维蛋白原、凝血酶、基底膜蛋白多糖、层粘连蛋白、纤连蛋白、重组纤连蛋白、蛋白聚糖、前胶原、透明质酸、巢蛋白、硫酸乙酰肝素、腱糖蛋白、聚-L-赖氨酸、明胶、聚-L-鸟氨酸、细胞外基质蛋白质(Fischer或LifeTech)、凝血酶片(纤维蛋白封闭剂,RelisealTM,RelianceLifeSciences)、纤维蛋白原和凝血酶片(RelianceLife)以及其任何组合。103.根据权利要求101所述的方法，其中所述基质或细胞外基质包括减少生长因子的或其等同物或胶原。104.根据权利要求101所述的方法，其中所述角膜缘干细胞分化培养基不含饲养层且是化学成分确定的培养基。105.根据权利要求104所述的方法，其中所述不含饲养层且是化学成分确定的培养基包括CnT-30培养基(CellntecAdvancedCellSystemsAG,伯尔尼,瑞士)、CnT-02(Cellntec)、CnT-02-3DP5(Cellntec)或功能等同物，其中所述培养基促进LSC分化为CEC。106.根据权利要求101所述的方法，其中CEC表达一组标志物，所述组标志物包括WNT7A、FZD5、PAX6、角蛋白3(K3)和角蛋白12(K12)，其相对于LSC，具有统计学上显著更高的K3和K12表达，并且相对于LSC，具有统计学上显著更低的K19表达。107.根据权利要求106所述的方法，其中CEC不表达p63或相比于LSC表达显著更低水平的p63，并且不表达角蛋白1(K1)和角蛋白10(K10)或相比于皮肤或表皮细胞表达显著更低水平的角蛋白1(K1)和角蛋白10(K10)。108.根据权利要求101所述的方法，其中每隔一天更换所述LSC分化培养基。109.一种分离的角膜缘干细胞(LSC)或LSC样细胞群体，其由根据权利要求60或64所述的方法获得。110.根据权利要求109所述的细胞，其中所述LSC表达一组标志物，所述组标志物包括WNT7A、FZD5、PAX6、p63、角蛋白5(K5)、角蛋白14(K14)、角蛋白19(K19)和Ki67。111.一种分离的角膜上皮细胞(CEC)群体，其由根据权利要求101所述的方法获得。112.根据权利要求111所述的细胞，其中所述CEC表达(i)一组标志物，所述组标志物包括WNT7A、FZD5、PAX6、角蛋白3(K3)和角蛋白12(K12)，其相比于LSC，具有统计学上显著更高的K3和K12表达，并且相比于LSC，具有统计学上显著更低的K19表达，并且(ii)不表达p63或相比于LSC表达显著更低水平的p63，并且不表达角蛋白1(K1)和角蛋白10(K10)或相比于皮肤或表皮细胞表达显著更低水平的角蛋白1(K1)和角蛋白10(K10)。113.一种用于角膜组织修复的试剂盒，其包含通过根据权利要求60、64或101所述的方法产生的LSC、LSC样细胞或CEC、或其所述细胞的组合、填充材料和使用说明书。114.根据权利要求113所述的试剂盒，其进一步包含药学上可接受的载体。115.根据权利要求114所述的试剂盒，其中所述药学上可接受的载体是用于支持细胞在曲部如人眼或动物眼的曲部中附着或生长的接触透镜或其等同物。116.根据权利要求115所述的试剂盒，其进一步包含人羊膜或动物羊膜。117.一种用于治疗患有与机能障碍性角膜缘干细胞或角膜上皮细胞相关的疾病的受试者的方法，其中所述方法包括：a.向受试者受影响的眼移植根据权利要求1、6、7或8所述的LSC细胞、LSC样细胞、CEC细胞或CEC样细胞，其中所移植的细胞填充所述受试者受影响的眼的角膜或角膜缘并恢复正常角膜清澈性和透明性，从而治疗患有所述与机能障碍性角膜缘干细胞或祖细胞或角膜上皮细胞相关的疾病的受试者。118.一种用于治疗患有与机能障碍性角膜缘干细胞或角膜上皮细胞相关的疾病的受试者的方法，其中所述方法包括：(a)向受试者受影响的眼移植通过根据权利要求47、48、55、60、64、70或101所述的方法产生的LSC细胞、LSC样细胞、CEC细胞或CEC样细胞，其中所移植的细胞填充所述受试者受影响的眼的角膜或角膜缘并恢复正常角膜清澈性和透明性，从而治疗患有所述与机能...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·张，H·欧阳，R·候，H·蔡，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US