祖细胞、其制备方法及其应用技术

本发明专利技术系提供一种祖细胞及其制备方法。该制备方法包括由子宫取得包含子宫肌层之组织样本，以胶原蛋白酶处理该组织样本，及培养该经处理之组织样本以获得该祖细胞，其中该祖细胞具有多能性及免疫调节性。本发明专利技术亦提供一种治疗退化性疾病、缺血性疾病或由异常免疫反应所致疾病之方法，系包括对罹患该疾病之病患提供该祖细胞。

Progenitor cell, method for the preparation thereof and use thereof

The present invention provides a progenitor cell and a process for its preparation. The preparation method comprises obtaining from uterine myometrial tissue contains samples in the tissue samples and cultured the collagen enzyme treatment, treated tissue samples to obtain the progenitor cells, wherein the pluripotent progenitor cells and immune regulation. The present invention also provides a method for treating degenerative diseases, ischemic diseases, or diseases caused by abnormal immune responses, comprising providing the progenitor cells to patients suffering from the disease.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】祖细胞、其制备方法及其应用交叉引用相关申请本案系主张美国临时专利申请案(申请号62/052,088，申请日2014年9月18日)之优先权。
本专利技术系关于多能性(multipotent)祖细胞、一种自子宫体(uterinecorpus)制备祖细胞之方法、及该祖细胞之应用。先前技术祖细胞疗法似乎已成为治愈退化性疾病之最佳解答，退化性疾病(如帕金森氏症)及缺血性疾病(如中风及心肌梗塞)—所有疾病实体均与老化族群高度相关。目前，人类祖细胞(亦已知为干细胞)来源系包含全能性干细胞(PSC)(如人类胚胎干细胞(hESC)及诱导性全能性干细胞(iPS))及成人干细胞(ASC)(如骨髓间叶干细胞(BMMSC)及神经干细胞)。然而，各种来源均无法排除其临床使用上的缺点：全能性干细胞有道德伦理上与肿瘤发生的疑虑(参考文献：Thomson,J.A.,Itskovitz-Eldor,J.,Shapiro,S.S.,Waknitz,M.A.,Swiergiel,J.J.,Marshall,V.S.,andJones,J.M.(1998).Embryonicstemcelllinesderivedfromhumanblastocysts.Science282,1145-1147；Yamanaka,S.(2009).AfreshlookatiPScells.Cell137,13-17)，而成人干细胞则为非常稀少的细胞，须以侵入式手段获得，且细胞数量与干细胞功能系随年纪及体外(exvivo)扩增而递减(参考文献：Rao,M.S.,andMattson,M.P.(2001).Stemcellsandaging:expandingthepossibilities.MechAgeingDev122,713-734；以及Ho,P.J.,Yen,M.L.,Tang,B.C.,Chen,C.T.,andYen,B.L.(2013).H2O2accumulationmediatesdifferentiationcapacityalteration,butnotproliferativedecline,insenescenthumanfetalmesenchymalstemcells.AntioxidRedoxSignal18,1895-1905(“Hoetal”))。子宫为女性生殖道中的器官之一，功能为容存人类胎儿及提供营养至生产。为了适应怀孕之生理需求而能够密集生长，子宫体主要由平滑肌细胞(子宫肌层)所构成且为高度血管化。移除子宫、或子宫切除术(hysterectomy)，系对未怀孕妇女最常见的手术程序；在美国，超过60岁的妇女有三分之一接受过子宫切除术(参考文献：Schaffer,J.I.,andWord,A.(2002).hysterectomy--stillausefuloperation.NEnglJMed347,1360-1362；Carlson,K.J.,Nichols,D.H.,andSchiff,I.(1993).Indicationsforhysterectomy.NEnglJMed328,856-860；FrequentlyAskedQuestions:hysterectomy.(2009).OfficeonWomen’sHealth,U.S.DepartmentofHealth&HumanServices)。Onoetal.已报导称为“子宫肌层侧群干细胞(myoSP)”之细胞可由人类子宫所分离(参考文献：Ono,M.,Maruyama,T.,Masuda,H.,Kajitani,T.,Nagashima,T.,Arase,T.,Ito,M.,Ohta,K.,Uchida,H.,Asada,H.,etal.(2007).Sidepopulationinhumanuterinemyometriumdisplaysphenotypicandfunctionalcharacteristicsofmyometrialstemcells.ProcNatlAcadSciUSA104,18700-18705(“Onoetal,PNAS2007”))。子宫肌层组织必须培养于最低酶添加(0.02％)之培养基中达4-16小时，接着过滤(2次)及梯度筛选(Ficollpaque)，接着进一步以胰蛋白酶处理(trypsinized)。子宫肌层侧群干细胞(myoSPs)之特征为，能够流出(efflux)Hoechst33342染剂，其于流式细胞仪分析中显示为“侧群(sidepopulation)”，并具有CD31(+)、CD34(+)及CD44(-)。然而，子宫肌层侧群干细胞无法分化成软骨源细胞(chondrogeniccells)，亦未曾报导过可分化为神经源细胞(neurogeniccells)。Galvez等人之文献(Galvezetal.,InVivo2009)、WO2010/057965及WO2011/042547A1系揭露子宫肌层所衍生之间叶干细胞及其分离方法。所分离细胞系称为“成人子宫肌层祖细胞(AMP)”，系分离自子宫肌层组织。该子宫肌层组织系培养于无血清培养基，并仅选择小室之片段进一步培养。因此，该方法系用以选择类内皮细胞，且可据此说明结果所显示之该等分离所得成人子宫肌层祖细胞中具有高CD31(+)比例(小鼠AMP为>99.7％，人类AMP为>90％)。AMP之细胞表面标记状况为CD73(-)、CD31(+)及HLA-DR(+)。仅小鼠AMP之分化能力被揭露，该小鼠AMP具有骨生成(osteogenesis)、脂肪生成(adipogenesis)及神经发生(neurogenesis)，但缺乏软骨生成(chondrogenesis)。因此，对于获得祖细胞之替代性来源及制备该祖细胞之方法仍有需求。
技术实现思路
本专利技术系描述一种制备祖细胞之方法，包括：由子宫取得包含子宫肌层之组织样本，以酶处理该组织样本以移除纤维组织，及培养该经处理之组织样本以获得该祖细胞，以及其中该祖细胞具有多能性及免疫调节性。本专利技术亦提供一种由上述方法所得之祖细胞。本专利技术另提供一种治疗退化性疾病、缺血性疾病、或由异常免疫反应所致之疾病之方法，系包括对罹患该疾病之病患提供由上述方法所得之祖细胞。附图简单说明图1显示子宫肌层衍生之多能性祖细胞(MDMP)之特征。(A)与脂肪组织衍生干细胞相较之MDMP之增殖潜能。(B)MDMP为侧群(SP)细胞阴性表达。为检测侧群细胞，将MDMP与Hoechst33342染剂于维拉帕米(verapamil)存在或不存在下共培养，维拉帕米系阻挡Hoechst33342染剂之流出，即侧群细胞之活性。将碘化丙啶以最终浓度为2Ag/mL添加至该等细胞以将活细胞分闸，并进行流式细胞仪分析，该Hoechst33342染剂系于357nm激活且其荧光系以双波长分析(蓝色，402–446nm；红色，650–670nm)。(C)流式细胞仪之子宫肌层衍生之多能性祖细胞之表面标记图谱，灰色填满曲线为同型对照组：黑色未填满曲线为所指示之抗体。(C)于子宫肌层衍生之多能性祖细胞中，不同标记之免疫荧光染色；比例尺为100μm。图2显示本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备祖细胞之方法，包括：由子宫取得包含子宫肌层之组织样本，,以酶处理该组织样本以移除纤维组织，及培养该经处理之组织样本以获得该祖细胞，以及其中该祖细胞具有多能性及免疫调节性，并具有细胞表面标记CD34为阴性表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.18 US 62/052,0881.一种制备祖细胞之方法，包括：由子宫取得包含子宫肌层之组织样本，,以酶处理该组织样本以移除纤维组织，及培养该经处理之组织样本以获得该祖细胞，以及其中该祖细胞具有多能性及免疫调节性，并具有细胞表面标记CD34为阴性表达。2.如权利要求1所述之方法，其中该子宫系来自子宫切除术。3.如权利要求1所述之方法，其中该组织样本为活检样本或脱落样本。4.如权利要求1所述之方法，进一步包括：在以胶原蛋白酶处理该组织样本之前，自该组织样本移除子宫内膜及绒毛膜。5.如权利要求1所述之方法，其中该酶为胶原蛋白酶。6.如权利要求1所述之方法，其中该经处理之组织样本系培养于一血清补给培养基中。7.如权利要求1所述之方法，其中该祖细胞具有阳性表达之CD44、CD73、CD90、CD105或前述任意组合之细胞表面标记。8.如权利要求1所述之方法，其中该祖细胞具有阴性表达之CD31、CD14、CD45、CD19、HLA-DR、SidePop或前述任意组合之细胞表面标记。9.一种如权利要求1所制备之祖细胞，其具有阳性表达之CD44、CD73、CD90及CD105之细胞表面标记，及阴性表达之CD31、CD34、CD14、...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜伶汝，刘柯俊，严孟禄，
申请(专利权)人：财团法人卫生研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾,71