一种REGγ‑20S 蛋白酶体抑制剂的筛选系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种REGγ‑20S蛋白酶体抑制剂的筛选系统，所述筛选系统包括融合蛋白lucN(416‑linker1)‑REGγ和α7‑lucC(linker1‑394)；基于REGγ‑20S蛋白酶体通过REGγ与α7结合的内在机制，利用荧光素酶片段互补技术，对REGγ‑20S蛋白酶体抑制剂进行筛选。本发明专利技术构建的包含LucN(416‑linker1)‑REGγ和α7‑lucC(linker1‑394)两种融合蛋白的筛选系统，具有很好的筛选效果。本发明专利技术通过对筛选系统进行优化，提高了所述筛选系统的有效性和特异性，可以高效地进行REGγ‑20S蛋白酶体小分子化合物抑制剂的筛选。

Screening system for REG gamma 20S proteasome inhibitor and its application

The invention discloses a screening system for REG gamma 20S proteasome inhibitors, the screening system including lucN fusion protein (416 linker1) REG gamma and alpha 7 lucC (linker1 394); REG gamma 20S proteasome through the internal mechanism of REG gamma and alpha 7 based on the use of. Luciferase fragment complementation of REG technology, 20S gamma proteasome inhibitor screening. The present invention includes LucN construction (416 linker1) REG gamma and alpha 7 lucC (linker1 394) two fusion protein screening system, has a very good screening effect. The screening system was optimized to improve the efficacy and specificity of the screening system, screening can efficiently REG gamma 20S proteasome inhibitor compounds.

【技术实现步骤摘要】
一种REGγ-20S蛋白酶体抑制剂的筛选系统及其应用
本专利技术涉及生物化学和生物材料
，具体涉及REGγ与20S蛋白酶体结合的分子机制以及应用该机制进行REGγ抑制剂的筛选和REGγ相关疾病的治疗。
技术介绍
蛋白酶体存在于真核生物、古细菌和一些细菌中，调控细胞内绝大多数蛋白质的降解与更新，对维持细胞正常的生命活动有着十分关键的作用。蛋白酶体复合体通常由两部分组成：一个圆筒形的20S核心颗粒和一个蛋白酶体激活因子(19S调节颗粒、11S激活因子以及Blm10/PA200)。20s蛋白酶体作为蛋白酶体复合体的核心部位，是由α、β两种亚基按照α7β7β7α7模型构成的一个28亚基复合体。由7个α亚基构成的环位于20s圆筒形结构的两端，7个β亚基构成的环位于内侧。α亚基类似于“门卫”，只有它所构成的环型处于打开状态时靶蛋白才可以进入，而β亚基的N端含有激活位点，起切断多肽的作用。三维结构分析显示，在没有蛋白酶体激活因子存在的情况下，β环处于闭合状态，被α亚基N端的多肽堵塞；而当蛋白酶体激活因子与β亚基的N端结合时，α亚基N端的多肽被移除，底物蛋白即可进入20s蛋白酶体。β亚基作为催化亚基，其中β1、β2、β5为活性位点，分别具有特异性的半胱天冬酶，类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性，用于切割进入核心颗粒内部的蛋白底物。蛋白酶体激活因子主要包括两类：19S蛋白酶体激活因子和11S蛋白酶体激活因子。19S蛋白酶体激活因子能够与蛋白酶体结合形成19S-20S-19S的26S蛋白酶体复合物，以泛素和ATP依赖的方式降解底物蛋白。而11S蛋白酶体激活因子则与蛋白酶体结合形成11S-20S-11S的蛋白酶体复合物，以非泛素和ATP依赖的方式降解底物蛋白。11S蛋白酶体激活因子家族有三个不同的成员：REGα，REGβ和REGγ。REGα/REGβ是免疫蛋白酶体，其作用是参与MHC-1类配体的抗原呈递。REGγ(别名PA28γ或PSME3)最初是在一种系统性红斑狼疮病人的血清中被发现的，其是一种高度保守的能被自身抗体所检测到的核内蛋白，因此被命名为Ki抗原。之前报道REGγ只有降解短肽类底物的能力，直到2006年李晓涛等人第一次揭示REGγ介导的20S蛋白酶体通过非泛素和ATP依赖途径直接降解类固醇受体辅调节蛋白3，从而发现REGγ具有降解完整蛋白的功能，进一步的研究表明其在多种疾病中具有重要的作用。近年来，随着对REGγ研究的不断深入，REGγ在癌症发生发展的作用也显得越来越关键。已经有研究表明REGγ在直肠癌、甲状腺癌和乳腺癌以及淋巴癌中高表达，最新研究表明REGγ还能促进皮肤癌和结肠癌的发生发展，REGγ在恶性肿瘤、复发性肿瘤以及炎症相关性肿瘤中的高表达揭示出REGγ在肿瘤发生发展过程中可能起到极为重要的作用。以上研究结果暗示REGγ可能是癌症治疗中一个潜在的靶蛋白，如何抑制REGγ-20S蛋白酶体的功能将成为一个有效的肿瘤治疗新方法。通过上述阐述证明了REGγ-蛋白酶体降解系统在肿瘤以及各种疾病中的作用，因此，通过药物筛选系统找出基于REGγ-蛋白酶体系统的抑制剂(小分子化合物)非常重要。美国食品药品监督管理局(FDA)批准的蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib)，卡非佐米Carfilzomib和Ixazomib主要用于治疗多发性骨髓瘤，然而在实体肿瘤的治疗中，还没有任何蛋白酶体抑制剂的报道。在过去十几年间，研究人员研究如何抑制或者激活蛋白酶体的功能以治疗相关疾病。但是这些蛋白酶体抑制剂能够治疗癌症是依赖于这些抑制剂能调节癌细胞增殖以及有些类型的癌细胞对蛋白酶体的功能有特异性的依赖。然而，由于蛋白酶体在生物体内具有极其重要的作用，因此这些作为药物的蛋白酶体抑制剂能够完全抑制蛋白酶体的活性，所以这种蛋白酶体抑制剂的使用也会对病人产生比较强烈的副作用，例如病人可能会有严重的失眠、头疼、恶心、腹泻等不良反应。因此，特异性的基于REGγ-蛋白酶体系统的抑制剂(小分子化合物)将可能是一种更好的研究方向，对疾病的预防以及诊治工作有重大意义。蛋白质片段互补技术可以通过多种报告基因准确快速的研究蛋白质之间的相互作用，是研究蛋白质相互作用的一个非常有力的工具。为蛋白酶体抑制剂(小分子化合物)的筛选提供了一个强有力的技术平台。其中荧光素酶是其最常用的报告基因之一。荧光素酶广泛应用在生物体光学成像中，常见的荧光素酶有两种，分别是海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶的底物是腔肠荧光素，一般产生蓝光(λmax＝475nm)，萤火虫荧光素酶的底物是D-荧光素，一般产生黄光到红光(λmax＝575-600nm)，它们的作用原理是在荧光素酶的催化作用下，底物被氧化发光，当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性。但是由于萤火虫荧光素酶发射光的波长更长不易被生物体组织吸收，所以这种荧光素酶在生物体中使用的更为广泛。荧光素酶片段互补技术能够实时监测位于细胞质、细胞核或者细胞膜上的蛋白互作，并不被限制在同一区域之中。荧光素酶片段互补技术也是一种可逆和高灵敏的技术，可以用来监测机体和细胞内的瞬时反应以及筛选蛋白质相互作用的抑制剂。随着近些年该技术的发展，如今这些技术在细胞和活体动物中为实时监测和研究小分子诱导的蛋白互作提供了一项技术平台，同时也提高了该技术在药物开发、化学遗传学、蛋白质组学等领域的创新性以及可行性的实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种REGγ-20S蛋白酶体抑制剂的筛选系统，利用荧光素酶片段互补技术对REGγ-20S蛋白酶体抑制剂进行筛选，本专利技术的筛选系统具有高效的检测能力，和高灵敏度、高特异性的特点。本专利技术提供了一种REGγ-20S蛋白酶体抑制剂的筛选系统，所述筛选系统包括融合蛋白lucN(416-linker1)-REGγ和α7-lucC(linker1-394)；其中，所述融合蛋白lucN(416-linker1)–REGγ通过荧光素酶N端片段1-416位通过连接多肽连接在REGγ的N端构建而成，所述融合蛋白α7-lucC(linker1-394)通过荧光素酶C端片段394-550位通过连接多肽连接在α7的C端。本专利技术还提供了一种REGγ-20S蛋白酶体抑制剂的筛选系统，所述筛选系统包括融合蛋白lucN-REGγ(K85QK86Q)和α7-lucC(linker1-394)；其中，所述融合蛋白lucN-REGγ(K85QK86Q)通过lucN-REGγ的核定位序列第85位赖氨酸进行突变而得，所述融合蛋白lucN-REGγ(K85QK86Q)位于细胞质中，能够显著增加荧光素酶的活性；所述融合蛋白α7-lucC(linker1-394)通过荧光素酶C端片段394-550位通过连接多肽连接在α7的C端。本专利技术还提供了一种融合蛋白lucN(416-linker1)–REGγ，其中，所述融合蛋白lucN(416-linker1)–REGγ通过荧光素酶N端片段1-416位通过连接多肽连接在REGγ的N端构建而成。本专利技术还提供了一种融合蛋白α7-lucC(linker1-394)；其中，所述融合蛋白α7-lucC(linker1-394)通过荧光素酶C端片段394-550位通过连接多肽连接在α7的C端本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种REGγ‑20S蛋白酶体抑制剂的筛选系统，其特征在于，所述筛选系统包括融合蛋白lucN(416‑linker1)‑REGγ和α7‑lucC(linker1‑394)；其中，所述融合蛋白lucN(416‑linker1)–REGγ通过荧光素酶N端片段1‑416位通过连接多肽连接在REGγ的N端构建而成，所述融合蛋白α7‑lucC(linker1‑394)通过荧光素酶C端片段394‑550位通过连接多肽连接在α7的C端。

【技术特征摘要】
1.一种REGγ-20S蛋白酶体抑制剂的筛选系统，其特征在于，所述筛选系统包括融合蛋白lucN(416-linker1)-REGγ和α7-lucC(linker1-394)；其中，所述融合蛋白lucN(416-linker1)–REGγ通过荧光素酶N端片段1-416位通过连接多肽连接在REGγ的N端构建而成，所述融合蛋白α7-lucC(linker1-394)通过荧光素酶C端片段394-550位通过连接多肽连接在α7的C端。2.一种REGγ-20S蛋白酶体抑制剂的筛选系统，其特征在于，所述筛选系统包括融合蛋白lucN-REGγ(K85QK86Q)和α7-lucC(linker1-394)；其中，所述融合蛋白lucN-REGγ(K85QK86Q)通过lucN-REGγ的核定位序列第85位赖氨酸进行突变而得；所述融合蛋白α7-lucC(linker1-394)通过荧光素酶C端片段394-550位通过连接多肽连接在α7的C端。3.一种融合蛋白lucN(416-linker1)–REGγ，其特征在于，所述融合蛋白lucN(416-linker1)–REGγ通过荧光素酶N端片段1-416位通过连接多肽连接在REGγ的N端构建而成。4.一种融合蛋白α7-lucC(...

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓涛，李磊，张变红，张坤，薛燕燕，翟万里，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：上海,31