日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白是由含日本血吸虫Vamp2基因的重组载体经表达而制得。本发明专利技术还公开了该日本血吸虫重组蛋白作为日本血吸虫诊断抗原的应用，以及该重组蛋白在制备预防或治疗血吸虫病的疫苗或药物中的应用。本发明专利技术的日本血吸虫重组蛋白，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组蛋白的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体并能达到一个较高水平，动物保护实验结果表明该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病候选疫苗及新药物靶标的潜力，诊断抗原的效果评估实验结果表明该重组蛋白具有作为诊断抗原的潜力，应用前景广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种日本血吸虫重组蛋白及其制备方法 和应用。
技术介绍
血吸虫病是一种严重危害人畜健康的重大寄生虫病，流行于全球76个国家和地 区，约6. 5亿人受感染威胁、2亿人感染，每年死亡人数超过10万。在我国流行的是日本血 吸虫病。虽然我国在血吸虫病的防治上已经取得了重大成就，但是由于中间宿主钉螺难以 消灭，终末宿主种类多、活动范围广、传染源难以控制，血吸虫重复感染现象严重，且存在免 疫逃避现象，全面控制血吸虫病传播的前景仍不容乐观。目前日本血吸虫病的防治难点主 要是缺乏安全有效的疫苗；现有的诊断方法敏感性、特异性不理想，且不能区分既往感染和 现症感染；批喹酮是目前唯一大规模应用的药物，且已有抗药性产生的报道。因此要加强血 吸虫生长发育关键分子的鉴定，以筛选新的候选疫苗分子、更加敏感、特异的诊断抗原以及 新的药物靶标。 日本血吸虫寄生于宿主体内的过程亦是其与宿主不断适应的过程，需要宿主为其 提供适宜的生理生化环境，并从宿主体内摄取自身无法合成的营养、激素等信号分子，同时 血吸虫能以其复杂的调控机制逃避宿主一系列的抗感染反应，又不会诱发严重的病理损害 而使宿主迅速死亡，从而使其生长发育繁殖得以延续。而体被是虫体与宿主接触的直接界 面，与虫体的营养摄取、代谢凋亡、信号传导、免疫应答等生理过程密切相关，因此体被表膜 蛋白的研究会为进一步发掘日本血吸虫的候选疫苗分子、更加敏感特异的诊断抗原及新的 药物靶标提供新的线索。 囊泡运输在细胞的生命活动过程中担任"物流系统"的角色，细胞要把基因表达的 产物定向运输到特定的地点行使功能，如神经递质的释放，激素的内分泌及酶和细胞因子 的外分泌，胞吞、胞吐等，细胞的这些重大生命过程均依赖于囊泡运输。若囊泡运输出现障 碍，则会出现神经系统疾病，代谢性疾病（如糖尿病）和免疫失调病等。囊泡运输的基本过 程包括：货物的招募、囊泡出芽、定向运输、入坞锚定、膜融合、货物的释放及蛋白重摄取等， 这既是基本的生命过程，又是一个极其复杂的动态过程，受到多种蛋白和调控因子的精密 调控。SNARE(可溶性N-乙基马来酰胺敏感因子附着蛋白受体）是促进囊泡膜与靶膜融合 的特殊蛋白复合体，被誉为膜融合的"发动机"，而Vamp2 (囊泡膜蛋白）是SNARE的重要组 成部分，正是其参与形成SNARE的过程拉动了囊泡膜与靶膜的融合。目前的研究表明Vamp2 参与形成SNARE的过程是囊泡运输过程中的限速步骤，由此可见囊泡膜蛋白在细胞生命活 动中担任着不可取代的角色。 目前关于Vamp2的研究表明：Vamp2主要参与胰岛素依赖性的GLUT4转运过程；其 与糖尿病的发病机制密切相关；肉毒神经毒素 B型通过裂解Vamp2而发挥其神经毒力作用； Vamp2参与细胞膜的更新成分胆固醇和LDL的运输，并与精卵融合等过程密切相关。还有文 献报道日本血吸虫的抗原分子伪装机制可能与虫体宿主间的囊泡运输有关，这将为研究血 吸虫的免疫逃避现象提供新思路。本实验室在日本血吸虫体被表膜蛋白质组学的研究中发 现了日本血吸虫囊泡膜蛋白SjVamp2,但是其在日本血吸虫生长发育过程中发挥的重要作 用还有待进一步研究。 到目前为止,还没有出现关于日本血吸虫SjVamp2重组蛋白作为血吸虫疫苗、或 作为敏感特异的诊断抗原的公开报道。
技术实现思路
本专利技术要解决目前缺乏抗血吸虫高效疫苗的技术问题，提供一种日本血吸虫重组 蛋白，该重组蛋白包含日本血吸虫囊泡膜蛋白（SjVamp2)的氨基酸序列，具有良好的免疫 原性，适于作为抗血吸虫病候选疫苗。 为此，还需要提供一种上述日本血吸虫重组蛋白的制备方法和应用。 为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现： 在本专利技术的一个方面，提供了一种重组载体，包含日本血吸虫Vamp2基因，该基因 序列是编码SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列。 优选的，所述基因序列是SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列。 更优选的，所述重组载体的空载体为原核表达载体pET28a(+)，所述日本血吸虫 Vamp2基因插入在空载体pET28a(+)的EcoR I和Xho I两个酶切位点之间。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种日本血吸虫重组蛋白，该重组蛋白是由上述 重组载体经表达而制得。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组蛋白的制备方法，包括 以下步骤： 构建含日本血吸虫Vamp2基因的重组表达载体； 将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞； 培养包含所述重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组 表达载体表达日本血吸虫Vamp2蛋白。 优选的，还包括步骤：将诱导表达获得的日本血吸虫Vamp2蛋白进一步纯化。 在本专利技术的一个具体实施例中，构建含日本血吸虫囊泡膜蛋白基因（SjVamp2)的 重组表达载体，具体包括以下步骤：利用生物信息学进行分析，根据编码日本血吸虫囊泡 膜蛋白（SjVamp2)的核苷酸序列设计PCR引物，并在两端加上特异限制性内切酶酶切位 点，PCR扩增核酸片断，再利用特异限制性内切酶EcoR I、Xhol将编码SjVamp2蛋白的 核酸片段定向克隆至原核表达载体pET28a (+)的多克隆位点区，构建重组原核表达质粒 pET28a(+)-SjVamp2 〇 在本专利技术的另一方面，还提供了 一种包含上述日本血吸虫重组蛋白的抗血吸虫疫 苗。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种日本血吸虫诊断抗原，该诊断抗原为上述日 本血吸虫重组蛋白。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种诊断日本血吸虫病的试剂盒，包含上述日本 血吸虫诊断抗原。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种能与上述日本血吸虫重组蛋白特异性结合的 抗体。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述日本血吸虫重组蛋白在制备预防或治疗 血吸虫病的疫苗或药物中的应用。 在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述重组载体在制备预防或治疗血吸虫病的 疫苗或药物中的应用。 本专利技术日本血吸虫重组蛋白，在小鼠免疫实验中可诱导小鼠体内产生抗重组蛋白 的特异性IgG、IgGl和IgG2a抗体并且能达到一个较高水平，动物保护实验分别诱导34. 7% 的减虫率和35. 1 %的减卵率，表明该重组蛋白具有发展为抗血吸虫病候选疫苗及新药物靶 标的潜力。诊断抗原的效果评估实验结果显示，本专利技术重组蛋白作为诊断抗原，敏感性达到 96%，特异性达到98%，表明本专利技术SjVamp2重组蛋白作为诊断抗原有一定潜力，具有很好 的应用价值。【附图说明】 下面结合附图和【具体实施方式】对本专利技术作进一步详细的说明。 图1是本专利技术实施例1的重组质粒pET28a⑴-SjVamp2的PCR鉴定结果图； 图2是本专利技术实施例1的日本血吸虫重组蛋白表达及纯化结果图； 图3是本专利技术实施例2的日本血吸虫重组蛋白免疫原性及抗原性检测结果图； 图4是本专利技术实施例3的实时定量PCR分析SjVamp2在不同发育阶段血吸虫内的 差异表达图； 图5是本专利技术实施例3的实时定量PCR分析SjVamp2在不同宿主来源虫体中的相 对表达量图； 图6是本专利技术实施例3的实时定量PCR分析SjVamp2在不同剂量吡喹酮治疗后不 同时间的相对表达量图； 图7是本专利技术实施例4的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组载体，其特征在于，包含日本血吸虫Vamp2基因，该基因序列是编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林矫矫，傅志强，韩倩，曹晓丹，洪炀，陆珂，刘艳涛，马帅，马茜茜，陆看，吕超，王涛，宰金丽，贾秉光，张祖航，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31