本发明专利技术公开了一种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒及其引物和探针，该试剂盒包括以下成分：100mM Tris-HCl，100mM KCl，20mM MgCl2，20mM DTT，20％DMSO，4mM NTP，1mM dNTP，各0.125μM的Primer-1、Primer-2，以及0.25μM分子信标探针；1.6U/μL AMV反转录酶，8U/μL T7RNA聚合酶，0.04U/μL Rnase H，2U/μL Ribonuclease Inhibitor，0.1％的BSA。本发明专利技术通过设计并结合临床样本筛查优化选择出的特异性正向引物、反向引物和分子信标探针，同步识别乙型脑炎病毒的3个不同区域，保证了扩增的特异性；可检测出样品中所含的个位拷贝数的乙脑病毒RNA，提高了乙脑检测的敏感性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒核酸检测
，涉及一种基于核酸序列依赖性扩增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)技术的日本乙型脑炎病毒快速检测技术。具 体涉及日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增快速检测试剂盒，以及所述试剂盒中使用的对 于乙型脑炎NSl基因具有特异性的引物对和分子信标探针。
技术介绍
日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒 属，是一种危害严重的人畜共患病病原。该病毒为单股正链RNA病毒，其核酸序列编码了 3 个结构蛋白和7个非结构蛋白（Nonstructural protein)，其中各基因型间NSl蛋白的同源 性较高，是建立该病核酸检测的良好候选基因。日本乙型脑炎经蚊传播，多见于夏秋季，对 患者神经系统的造成不可逆的损伤，病死率高，部分幸存者会遗留中枢神经系统后遗症。我 国为日本乙型脑炎高发区，平均年发病数约占全世界乙脑发病数的80%，且主要危害人群 为儿童，对人民的健康造成极大的危害。因此建立一套简便快速、特异性强的日本乙型脑炎 病毒检测技术，对该病的防控和临床诊有着十分重要的意义。 由于乙脑的流行具有明显的季节性、地区性和临床病变，可以据其进行初步诊断， 但确诊还是需要通过实验室诊断，主要包括病毒的分离鉴定、酶联免疫法和RT-PCR等。病 毒分离培养法操作繁琐，耗时很长，不适于快速检测和临床紧急病情处理；酶联免疫检测 技术受其本身的限制，灵敏度比较低，不利于病程初期的诊断；RT-PCR、荧光RT-PCR以及 RT-LAMP等也是基于核酸扩增的检测方法，灵敏度较前两种方法提高了很多，但PCR的扩增 需要有反转录步骤以及变性、退火及延伸等多个温度点进行几十次升降温循环，耗时较长， 而LAMP方法对引物设计区域要求过高，在变异较大且频繁的RNA病毒上难以实现良好应 用。 核酸序列依赖性扩增（NASBA)与以往核酸扩增技术不同，更为高效简便，尤其 适用于RNA病毒的检测。NASBA在AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、RNA酶H的介导下，在 41°C -42°C恒温条件下，经一对引物在体外连续扩增出均一的特异性的核酸序列。在该技 术的基础上结合分子信标探针（moleular beacon)可以建立实时焚光NASBA (Real-time NASBA)扩增技术。Real-time NASBA具有以下特点：①在同一温度条件下进行的等温扩增； ②与RT-PCR相比，无需15-30分钟的反转录过程，不受引物量限制，在60-90分钟内使模板 RNA扩增IO9倍以上，灵敏度甚至可以达到检测拷贝数为个位的模板RNA ;③只对RNA模板 进行扩增，不受双链DNA污染的影响，且产物通过分子信标探针来检测，实现了实时检测并 减少了对环境的污染。④与RT-LAMP相比，更容易筛选出检测靶位点，满足变异度高的核酸 病毒检测要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于实时荧光核酸序列依赖性扩增技术（Real-time NASBA)对日本乙型脑炎NSl基因具有特异性检测作用的引物对和分子信标探针；此外，本 专利技术还提供了一种包含上述引物对和分子信标的日本乙型脑炎Real-time NASBA检测试剂 盒。 为了实现本专利技术的目的，专利技术人通过大量试验研宄并不懈努力，最终获得了如下 技术方案： -种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的特异性引物对，该引物对 包括正向引物Primer-I和反向引物Primer-2,所述正向引物和反向引物的碱基序列如下 所示： Primer-I :5, -GACGTTAGCAGGTAGACGAGGCATGATGAAACAACACTC-3,（SEQ ID NO :1); Primer-2 :5' -CTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCTCTTGCGAAGGAC-3'（SEQ ID NO : 2) 〇 一种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的分子信标探针Tagl，该 分子信标探针在其寡核苷酸DNA分子的5'端标记焚光报告基团FAM，3'端标记促灭基团 DABCYL，探针上的寡核苷酸DNA分子的碱基序列如SEQ ID NO :3所示。整个探针形式如下 所示： 5 ' FAM-CATCGCAGCTGGGCCTTCTGGTGATGTTTCTCGATG-DABCYL-3 '。 由于上述特异性引物对和分子信标探针可用来检测离体标本中是否存在乙型脑 炎病毒的NSl基因，进而确定样品中是否含有乙型脑炎病毒，因此本专利技术还提供一种产品 新用途，即：上述的特异性引物对在制备诊断或检测日本乙型脑炎病毒的试剂中的用途； 或者，上述的分子信标探针在制备诊断或检测日本乙型脑炎病毒的试剂中的用途。 本专利技术提供的一种日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒至少包括： 2 X实时荧光NASBA反应液和4 X酶混合液。所述2 X实时荧光NASBA反应液包含有如上 所述的正向引物Primer-Ι、反向引物Primer-2和分子信标探针；4X酶混合液包AMV反转 录酶、T7RNA聚合酶和RNase H酶等。 进一步优选，所述2X实时荧光NASBA反应液各组分见表1，4X酶混合液各组分 见表2。 表1 :2 X实时荧光NASBA反应液 所述的日本乙型脑炎病毒实时荧光等温扩增检测试剂盒还包括阳性对照、阴性对 照和空白对照，所述阳性对照为乙型脑炎体外转录NSl基因的RNA片段，所述阴性对照为在 核酸提取时与标本同时平行提取无菌生理盐水，所述空白对照为无核酸酶的超纯水。 与现有技术相比，本专利技术首次通过提供一种对乙型脑炎病毒NSl基因具有特异性 的一对引物和一条分子信标探针，包含上述引物对和分子信标探针的试剂盒，来检测离体 标本中是否存在乙型脑炎病毒的NSl基因，进而确定样品中是否含有乙型脑炎病毒；本发 明在设计筛选扩增引物时，以乙脑病毒检测的特异性和通用性为本，综合考虑引物和探针 的Tm值、3 '末端自由能，GC含量、RNA二级结构、Λ G等因素，并分析比较了日本乙型脑炎病 毒5个不同基因型毒株的基因序列，所设计筛选的引物可对不同基因型NSl进行检测。另 外，本专利技术所涉及的检测试剂盒具有以下优点： 1、等温扩增：避免了普通RT-PCR对温度循环的特殊要求所带来的种种不便； 2、特异：通过精心设计并结合临床样本筛查优化选择出的特异性正向引物、反向 引物和分子信标探针，同步识别乙型脑炎病毒的3个不同区域，保证了扩增的特异性； 3、灵敏：由于NASBA自身的扩增特点，使得检测灵敏度进一步提高，拷贝数为个位 的模板可被检出； 4、高效：可以在60-90分钟内完成检测，并使模板RNA扩增约IO9倍； 5、实时监测：NASBA扩增结束后马上可以分析数据获得检测结果，无需再次操作 减少对环境的污染。【附图说明】 图 I :NASBA 的 AMV buffer 体积的优化，其中，1 :2· 4 μ L ;2 :2· 8 μ L ;3 :3· 2 μ L ;4 : 3. 6 μ L ;5 :4. 0 μ L ;6 :4· 4 μ L ;7 :4· 8 μ L。 图 2 :NASBA 的 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于实时荧光等温扩增法检测日本乙型脑炎病毒的特异性引物对，其特征在于，该引物对包括正向引物Primer‑1和反向引物Primer‑2，Primer‑1的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，Primer‑2的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周丹娜，田永祥，刘学，郭锐，段正赢，杨克礼，袁芳艳，刘威，刘泽文，孟丽，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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