一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白的制备方法，(1)重组质粒pET-Fnbpb-D的构建，根据GenBank登录的基因序列(X62992)，用Primer5.0设计上游引物和下游引物，进行PCR扩增，经测序正确后进行表达；(2)pET-Fnbpb-D的诱导表达和可溶性鉴定，上述构建的重组质粒转入感受态细胞BL21(DE3)中，用终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导，取不同时间段的表达产物进行SDS-PAGE检测；(3)蛋白的大量表达及纯化，扩大培养后，根据预实验确定的最佳诱导时间和IPTG的浓度，进行大量表达和纯化。通过本发明专利技术方法可以制备Fnbpb靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗，为以Fnbpb为靶位的疫苗研究，对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据，为今后奶牛乳房炎的防治提供了基础。

Method for preparing Staphylococcus aureus adhesin protein

The invention discloses a preparation method of Staphylococcus aureus adhesin protein, (1) to construct the recombinant plasmid pET-Fnbpb-D, according to the gene sequence of GenBank log (X62992), designed by Primer5.0, the upstream primer and downstream primer, amplified by PCR and identified by sequencing of expression; (2) expression and soluble identification of pET-Fnbpb-D, the recombinant plasmid was transformed into competent cell BL21 (DE3), 1.0mM IPTG with the final concentration for induction, expression products in different time were detected by SDS-PAGE; (3) a large amount of protein expression and purification, after culture expansion, according to the optimum concentration of IPTG and the induction time of pre experiment sure, a lot of expression and purification. Preparation of Fnbpb target of Staphylococcus aureus mastitis vaccine through the method of the invention can, for Fnbpb vaccine research target, to provide the experimental basis for the study of Staphylococcus aureus mastitis vaccine, and provides the basis for future prevention and treatment of mastitis in dairy cows.

【技术实现步骤摘要】
一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白的制备方法
本专利技术涉及蛋白质合成领域，具体是一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白的制备方法。
技术介绍
奶牛乳房炎(BovineMastitis)是奶牛的常见疾病，是奶牛乳腺组织的炎症，主要为乳腺组织感染病原微生物所致，是奶牛的常见病、多发病。几十年来，国内外针对奶牛乳房炎的防治作了很多努力，但该病一直是困扰我国奶牛业养殖发展最为严重的疾病之一。它使奶牛泌乳和生殖机能受到损伤，不仅降低奶牛的产奶量，使奶牛淘汰，影响乳的品质造成严重的经济损失，严重时甚至影响到人类健康。S.aureus黏附到乳头管被认为是乳腺感染的第一步，因此，黏附到乳腺上皮细胞和细胞外基质上的能力对于S.aureus的致病性至关重要。S.aureus黏附的过程中有多种黏附因子参与，其中纤连结合蛋白B(Fibronectin-bindingproteinB，Fnbpb)是重要的黏附素之一，介导S.aureus结合与细胞表面的纤维连结素与纤维蛋白原，使细胞黏附与宿主细胞表面，促进细菌对宿主的侵入。因此，目前研究表明以Fnbpb为靶位进行疫苗的研制可能是预防奶牛S.aureus乳房炎的有效方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白的制备方法，具体步骤如下：(1)重组质粒pET-Fnbpb-D的构建根据GenBank登录的基因序列，用Primer5.0设计上游引物和下游引物，上游引物：5‘-CGGAATTCGCCCATAATAACGGTAACCAGT-3’下游引物：5’-CGCAAGCTTGCACGATTGGAGGTGATGTAT-3’；PCR扩增条件：93.5～94.5℃2min；93.5～94.5℃30s；63.5～64.5℃45s；71.5～72.5℃1min，30个循环；71.5～72.5℃10min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；经测序正确后进行表达；(2)pET-Fnbpb-D的诱导表达和可溶性鉴定上述构建的重组质粒转入感受态细胞BL21(DE3)中，用终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导，取不同时间段的表达产物进行SDS-PAGE检测；(3)蛋白的大量表达及纯化经鉴定，目的蛋白以可溶性形式存在，扩大培养后，根据预实验确定的最佳诱导时间和IPTG的浓度，进行大量表达和纯化。作为本专利技术进一步的方案：所述步骤(2)中的不同时间段为开始诱导后的1h、2h、3h、4h、5h。作为本专利技术再进一步的方案：所述步骤(3)中的最佳诱导时间为5h，最佳IPTG的浓度为1mmol/L。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：通过本专利技术方法可以制备Fnbpb靶位的金黄色葡萄球菌奶牛乳房炎疫苗，为以Fnbpb为靶位的疫苗研究，对金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎疫苗的研究提供试验依据，为今后奶牛乳房炎的防治提供了基础。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。金黄色葡萄球菌黏附素蛋白的制备步骤：(1)重组质粒pET-Fnbpb-D的构建根据GenBank登录的基因序列(X62992)，用Primer5.0设计上下游引物，序列为上游：5‘-CGGAATTCGCCCATAATAACGGTAACCAGT-3’和下游：5’-CGCAAGCTTGCACGATTGGAGGTGATGTAT-3’；PCR扩增条件：94℃2min；94℃30s；64℃45s；72℃1min，30个循环；72℃10min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；经测序正确后进行表达；(2)pET-Fnbpb-D的诱导表达和可溶性鉴定上述构建的重组质粒转入感受态细胞BL21(DE3)中，用终浓度为1.0mM的IPTG进行诱导，取不同时间段的表达产物进行SDS-PAGE检测；(3)蛋白的大量表达及纯化经鉴定，目的蛋白以可溶性形式存在，扩大培养后，根据预实验确定的最佳诱导时间和IPTG的浓度，进行大量表达和纯化。对于本领域技术人员而言，显然本专利技术不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本专利技术的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本专利技术。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本专利技术的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本专利技术内。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)重组质粒pET‑Fnbpb‑D的构建根据GenBank登录的基因序列，用Primer5.0设计上游引物和下游引物，上游引物：5‘‑CGGAATTCGCCCATAATAACGGTAACCAGT‑3’下游引物：5’‑CGCAAGCTTGCACGATTGGAGGTGATGTAT‑3’；PCR扩增条件：93.5～94.5℃2min；93.5～94.5℃30s；63.5～64.5℃45s；71.5～72.5℃1min，30个循环；71.5～72.5℃10min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；经测序正确后进行表达；(2)pET‑Fnbpb‑D的诱导表达和可溶性鉴定上述构建的重组质粒转入感受态细胞BL21中，用终浓度为0.9～1.1mM的IPTG进行诱导，取不同时间段的表达产物进行SDS‑PAGE检测；(3)蛋白的大量表达及纯化经鉴定，目的蛋白以可溶性形式存在，扩大培养后，根据预实验确定的最佳诱导时间和IPTG的浓度，进行大量表达和纯化。

【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌黏附素蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)重组质粒pET-Fnbpb-D的构建根据GenBank登录的基因序列，用Primer5.0设计上游引物和下游引物，上游引物：5‘-CGGAATTCGCCCATAATAACGGTAACCAGT-3’下游引物：5’-CGCAAGCTTGCACGATTGGAGGTGATGTAT-3’；PCR扩增条件：93.5～94.5℃2min；93.5～94.5℃30s；63.5～64.5℃45s；71.5～72.5℃1min，30个循环；71.5～72.5℃10min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测；经测序正确后进行表达；(2)pET-...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘海婷，
申请(专利权)人：中创云牧内蒙古科技咨询有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15