罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白疫苗的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白疫苗的制备方法及其应用。所述重组CBP蛋白疫苗由罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白制备得到。所述罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白的氨基酸序列如序列2所示。本发明专利技术以罗非鱼源无乳链球菌为研究对象，从罗非鱼源无乳链球菌基因组中克隆到Cbp基因，与pET28a(+)载体连接构建表达载体，在E.coliBL21(DE3)中进行原核表达和纯化，获得一种特异性强、具有免疫保护效力为56.35％±8.09％的重组CBP蛋白疫苗，为罗非鱼无乳链球菌病的免疫防治奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白疫苗的制备方法及其应用
本专利技术属于分子疫苗学
更具体地，涉及一种罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白疫苗的制备方法及其应用。
技术介绍
无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是一种人畜鱼共患革兰氏阳性菌，能引起新生儿脑膜炎、牛乳腺炎和鱼类脑膜脑炎。无乳链球菌能感染多种海水、淡水鱼类并引起死亡，给我国乃至世界水产养殖业造成重大经济损失。因此，研究无乳链球菌相关的防治技术具有很重要的现实意义。目前，在国内已有一些与链球菌疫苗相关的专利。申请号：200580013779.X，专利技术名称：无乳链球菌疫苗公布了一种β溶血性无乳链球菌的完整灭活细胞和该菌培养物的浓缩提取物制备的组合疫苗通过注射和浸泡两种方式对罗非鱼抗无乳链球菌的免疫保护效果分别为80％和35％。申请号：200780025577.6，专利技术名称：抗链球菌的联合疫苗公布了一种联合疫苗，当难辨链球菌和海豚链球菌在疫苗制剂中的比例(基于细胞∶细胞)为20∶1或40∶1时，可得到抗难辨链球菌的64％的相对保护率和抗海豚链球菌的71％的相对保护率。申请号：201080047156.5，专利技术名称：链球菌组合疫苗，公布了一种组合疫苗，包含无乳链球菌生物型1血清型Ia细胞和血清型III细胞的组合疫苗提供针对罗非鱼抗无乳链球菌生物型1血清型Ia的88.9％保护率和抗罗非鱼无乳链球菌生物型1血清型III的92％的保护率。申请号：201010207289.6，专利技术名称：罗非鱼二联链球菌灭活疫苗的制备方法，公布了一种罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌等体积混合二联疫苗的制备过程。申请号：201210337267.0，专利技术名称：一种预防罗非鱼链球菌病的疫苗，公布了一种无乳链球菌全菌灭活疫苗通过浸泡、注射和口服免疫罗非鱼后最高分别能达到60％、90％和75％的免疫保护率。申请号：201410121138.7，申请名称：一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法，构建一种表达无乳链球菌sip蛋白的重组减毒沙门氏菌，将其拌料投喂罗非鱼后最高可获得63％的抗无乳链球菌免疫保护率。但是，以上公开使用的无乳链球菌疫苗均是单一或是二联全菌灭活疫苗，制备出的疫苗免疫效力与疫苗菌株的免疫原性直接相关，并且只对血清型一致的无乳链球菌有效，对海豚链球菌没有效果。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种罗非鱼源无乳链球菌Cbp基因编码的重组CBP蛋白，并作为重组蛋白疫苗来防治罗非鱼无乳链球菌病，能够对罗非鱼抗无乳链球菌不同血清型产生特异性的保护性。该重组蛋白疫苗的制备方法简单、制备过程安全，疫苗对罗非鱼抗无乳链球菌的免疫保护率达到56.35％±8.09％。本专利技术的目的是提供一种罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白疫苗的制备方法。本专利技术另一目的是提供所述罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白疫苗的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种罗非鱼源无乳链球菌Cbp基因，其核苷酸序列如序列1所示。所述的罗非鱼源无乳链球菌Cbp基因是从罗非鱼源无乳链球菌中克隆得到的。一种罗非鱼源无乳链球菌Cbp基因编码的重组CBP蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。所述重组CBP蛋白是由上述罗非鱼源无乳链球菌Cbp基因编码得到。另外，上述罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白的制备方法，包括如下步骤：S1.利用引物对CBP-F和CBP-R，将Cbp基因克隆到原核表达系统中，得到含重组质粒pET28a-CBP的工程菌；S2.将含重组质粒pET28a-CBP的工程菌进行扩大培养，纯化回收获得重组CBP蛋白；其中，所述引物CBP-F的序列如序列3所示，引物CBP-R的序列如序列4所示；所述Cbp基因的序列如序列1所示。另外，进一步优选地，步骤S1的具体方法是：S11.克隆Cbp基因：以罗非鱼源无乳链球菌基因组DNA为模板，以引物CBP-F和CBP-R进行PCR克隆Cbp基因；S12.构建CBP克隆菌株：将克隆的Cbp基因连接到pET28a载体，并转化E.coliDH5α感受态细胞，利用卡那青霉素筛选得到含有重组质粒pET28a-CBP的阳性CBP菌株；S13.构建CBP表达菌株：将重组质粒pET28a-CBP转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，经卡那青霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆细胞，即为含重组质粒pET28a-CBP的工程菌。其中，更优选地，步骤S11所述PCR反应体系为：25μl反应体系含50ng模板DNA(基因组DNA)，2.5μl10×PCRBuffer(Mg+)，2μldNTPMixture(2.5mM)，1μlCBP-F，1μlCBP-R，0.125μlrTaq(5U/μl)，加灭菌蒸馏水至25μl。更优选地，步骤S11所述PCR条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性30s，53℃退火35s，72℃延伸2min下作用30个循环；最后72℃延伸8min；4℃保温。更优选地，步骤S12所述连接的体系为：20μl体系内含3μlPCR产物，1μlVector，2μl10×Buffer，1μlEnzymeMixA，13μlddH2O。(注：连接体系所用载体、酶、缓冲液均来自斯丹赛生物技术公司‘如意连试剂盒’)更优选地，步骤S12的具体方法如下：将步骤S11所述PCR的产物回收纯化后与pET28a载体连接，37℃下连接30min；将10μl连接产物转入100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min；然后加入500μlLB液体培养基，37℃震荡培养45min；4000rpm离心5min，留100μl吹打沉淀菌液，将混合液加入含有50μg/ml卡那青霉素(Kan+)的LB固体培养基上，涂布均匀后在37℃培养过夜；随机挑取平板上的10个单菌落鉴定，鉴定结果为阳性的单菌落即为CBP克隆菌株。更优选地，步骤S13的具体方法如下：将5μl质粒pET28a转入100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min；然后加入500μlLB液体培养基，37℃震荡培养45min；4000rpm离心5min，留100μl吹打沉淀菌液，将混合液加入含有50μg/ml卡那青霉素(Kan+)的LB固体培养基上，涂布均匀后在37℃培养过夜；随机挑取平板上的10个单菌落鉴定，鉴定结果为阳性的单菌落即为CBP表达菌株。进一步优选地，步骤S2的具体方法如下：S21.将含有重组质粒pET28a-CBP的工程菌单菌落接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中，震荡培养10h；S22.将菌液加入含有卡那霉素的LB液体培养基中，扩大培养2h，至OD600为0.6；S23.向菌液中加入IPTG诱导培养后，利用咪唑洗脱液纯化回收，得到纯化的重组CBP蛋白，即为所述罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。其中，更具体优选地，步骤S2的具体方法如下：S21.将含有重组质粒pET28a-CBP的E.coliBL21(DE3)单菌落接种于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下200r/min震荡培养10h；S22.将5ml菌液加入500ml含有50μg/m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种罗非鱼源无乳链球菌Cbp基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种罗非鱼源无乳链球菌Cbp基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列1所示。2.一种罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如序列2所示。3.根据权利要求1所述罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白，其特征在于，所述重组CBP蛋白是由权利要求1中所述罗非鱼源无乳链球菌Cbp基因编码得到。4.权利要求2或3所述罗非鱼源无乳链球菌重组CBP蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.利用引物对CBP-F和CBP-R，将CBP基因克隆到原核表达系统中，得到含重组质粒pET28a-CBP的工程菌；S2.将含重组质粒pET28a-CBP的工程菌进行扩大培养，纯化回收获得重组CBP蛋白；其中，所述引物CBP-F的序列如序列3所示，引物CBP-R的序列如序列4所示；所述Cbp基因的序列如序列1所示。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S1的具体方法是：S11.克隆Cbp基因：以罗非鱼源无乳链球菌基因组DNA为模板，以引物CBP-F和CBP-R进行PCR克隆Cbp基因；S12.构建CBP克隆菌株：将克隆的Cbp基因连接到pET28a载体，并转化E.coliDH5α感受态细胞，利用卡那青霉素筛选得到含有重组质粒pET28a-CBP的阳性CBP菌株；S13.构建C...

【专利技术属性】
技术研发人员：李安兴，李云，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44