一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用制造技术

本发明专利技术涉及免疫学领域，具体的说是一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用。海豚链球菌DNA疫苗为pCNSiE。本发明专利技术的疫苗对海豚链球菌的免疫保护效率达95％本发明专利技术的疫苗在免疫后两个月内的免疫保护效率没有明显减弱。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及免疫学领域，具体的说是一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用。海豚链球菌DNA疫苗为pCNSiE。本专利技术的疫苗对海豚链球菌的免疫保护效率达95％本专利技术的疫苗在免疫后两个月内的免疫保护效率没有明显减弱。【专利说明】—种海豚链球菌DNA疫苗及其应用
本专利技术涉及免疫学领域，具体的说是一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用。
技术介绍
海豚链球菌(Streptococcus iniae)为一种革兰氏阳性菌,属于链球菌属，是养殖鱼类主要病原菌之一。在我国，海豚链球菌危害的鱼类包括罗非鱼、牙鲆、美国红鱼、鲷类等。除了水生动物外，海豚链球菌还能够感染人类和其它动物，是一种典型的人畜共患病原，其感染人类后可造成各种软组织炎症以及败血症等。在我国，至今没有商业化海豚链球菌疫苗，对海豚链球菌相关病害的防治一直以抗生素和化学药物为主。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种海豚链球菌DNA疫苗及其应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为:一种海豚链球菌DNA疫苗，疫苗为pCNSiE。具体为:以海豚链球菌G26为模板经 引物F1/R1进行PCR扩增，扩增产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒pCNSiE，即为海豚链球菌DNA疫苗；所述引物序列为:Fl:5’ -CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3 ；Rl:5，-CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3，。所述质粒pCNSiE在PBS中稀释至终浓度为150 μ g/ml，作为疫苗制备液。所述疫苗为注射剂。一种海豚链球菌DNA疫苗的制备方法，以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR产物纯化后与用Sma I酶切的质粒pCN3连接，连接液转化到大肠杆菌DH5 α后在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养18 — 24小时，接转化后质粒为pCNSiE，即为海豚链球菌DNA疫苗质粒。一种海豚链球菌DNA疫苗的应用，所述质粒pCNSiE用于制备海豚链球菌的免疫疫苗中的应用。本专利技术具有如下优点:1.高保护率。本专利技术的疫苗对海豚链球菌的免疫保护效率达95%。2.长效。本专利技术的疫苗在免疫后两个月内的免疫保护效率没有明显减弱。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。实施例1DNA疫苗质粒pCNSiE的构建:以海豚链球菌G26为模板，采用F1/R1为引物进行PCR扩增，PCR条件为:94 V 60s预变性模板DNA，然后94 °C 40s, 52 V 60s, 72 V 60s, 5个循环后改为940C 40s, 63°C 60s, 72°C 60s, 25个循环后再在72°C延伸反应10min。PCR产物用天根DNA产物纯化试剂盒纯化。将质粒pCN3 (pCN3构建过程参见Jiao XD, Zhang M，Hu YH, SunL.Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tardaantigens.Vaccine 2009; 27:5195 202.)用 Sma I 酶切，回收 5.4kb 片段，将其与上述纯化的PCR产物用T4DNA连接酶于室温连接2 — 4小时，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB固体培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pCNSiE。PCR 引物为 Fl:5’ -CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3’和 Rl:5’ -CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3’。所述菌株G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为:CGMCC N0.1984，分类命名为海豚链球菌(Sti^ptococcus iniae)，保藏日期为2007年3月22日，保藏单位地址为北京市海淀区中关村北一条13号。所述LB组成成分按重量百分比计:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97.5%蒸馏水.实施例2疫苗pCNSiE的应用步骤I)疫苗制备液的制备。将上述DNA疫苗pCNSiE质粒在PBS中稀释至终浓度为150 μ g/ml,即为疫苗制备液。所述PBS 组成成分按重量百分比计:0.8%NaCl, 0.02%KC1, 0.358%Na2HP04.12H20, 0.024%NaH2P04,余量为水。步骤2)疫苗的接种。将100条牙鲆(每条重约11.2g)随机分为4组，每组25条。将这4组分别命名为A、B、C和D。将A和C组的每条鱼腹腔注射IOOul上述步骤I)的疫苗制备液，将B和D组(对照组)的每条鱼腹腔注射IOOul PBS0步骤3)海豚链球菌悬液的制备。在LB培养基中培养海豚链球菌G26至0D_为0.8，然后离心(5000g，4°C，IOmin),收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为lxl08cfu/ml，即为G26悬液。步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在步骤2)免疫注射后一个月，用上述步骤3)的G26悬液腹腔注A和B组鱼，每条鱼的注射量为IOOul。在步骤2)免疫注射后两个月，用上述步骤3)的G26悬液腹腔注射C和D组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目:A组，I条；B组，19条；C组，2条；D组，17条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS):RPS=100x(l 一免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)由此得出疫苗pCNSiE免疫一个月和两个月时对海豚链球菌的免疫保护率分别为95%和88%。因此，pCNSiE是一种非常`高效的DNA疫苗。【权利要求】1.一种海豚链球菌DNA疫苗，其特征在于:疫苗为pCNSiE。2.按权利要求1所述的海豚链球菌DNA疫苗，其特征在于: 以海豚链球菌G26为模板经引物F1/R1进行PCR扩增，扩增产物与载体pCN3质粒连接转化后质粒pCNSiE，即为海豚链球菌DNA疫苗； 所述引物序列为:Fl:5’ -CCCGGGATGATTTTTGGAAAAAGTAGTAATGGA-3 ；Rl:5’ -CCCGGGCCTTCTTACCTTTGACTGAT-3’。3.按权利要求1或2所述的海豚链球菌DNA疫苗，其特征在于:所述质粒pCNSiE在PBS中稀释至终浓度为150 μ g/ml，作为疫苗制备液。4.按权利要求1或2所述的海豚链球菌DNA疫苗，其特征在于:所述疫苗为注射剂。5.一种权利要求1所述的海豚链球菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海豚链球菌DNA疫苗,其特征在于：疫苗为pCNSiE。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，孙云，孙铂光，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：