用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的LAMP引物组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的LAMP引物组合及其应用。本发明专利技术提供的引物组合，由序列1至序列6所示的6种DNA分子组成。所述引物组合可应用于检测待测菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，可应用于检测待测样本中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。本发明专利技术提供的引物组合用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明专利技术具有重大的推广价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的LAMP引物组合及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌LAMP引物组合及其应用。
技术介绍
抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物。近年来，感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素滥用情况最为严重的国家之一，随着抗生素使用量的加大，细菌耐药的情况也越发严重。抗生素种类繁多，作用机制多样。甲氧西林(methicillin)为第一个应用于临床的耐青霉素酶半合成青霉素，对葡萄球菌产生的青霉素酶较其它耐酶青霉素稳定。金黄色葡萄球菌为临床常见的病原菌，具有较强的致病力，能引起皮肤软组织感染、血流感染及全身各脏器感染等。1961年首次分离得到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)，其对所有β-内酰胺类抗生素耐药，并对大环内酯类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等多种抗菌药物多数耐药，因此，导致该菌引起的感染治疗困难，病死率高。从20世纪80年代开始至今，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的感染者逐年增多并日益成为感染的主要病原菌之一。由于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillinsensitivestaphylococcusaureus，MSSA)和MRSA的治疗方式等有极大差异，因此临床上必须检测待测菌是否为MRSA。MRSA通常被定义为携带mecA基因的金黄色葡萄球菌和/或苯唑西林MIC≥4mg·L-1的金黄色葡萄球菌，目前鉴定MRSA的方法主要有纸片扩散法、微量肉汤稀释法、琼脂稀释法和苯唑西林平皿筛选法，但是这些检测方法均具有检测时间长(一般24h左右)和准确率低的缺点。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)具有简便、快速、灵敏、特异的优势，尤其适合在基层开展LAMP试剂盒的应用推广。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的LAMP引物组合及其应用。本专利技术首先提供了一种引物组合，由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；所述引物Ⅰ-F3可为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子。所述引物Ⅰ-B3可为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。所述引物Ⅰ-FIP可为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。所述引物Ⅰ-BIP可为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子。所述引物Ⅰ-LF可为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子。所述引物Ⅰ-LB可为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。所述引物组合中，所述引物Ⅰ-F3、所述引物Ⅰ-B3、所述引物Ⅰ-FIP、所述引物Ⅰ-BIP、所述引物Ⅰ-LF和所述引物Ⅰ-LB的摩尔比具体可为0.5：0.5：2：2：1：1。本专利技术还保护所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c2)或(c3)：(c2)用于检测待测样本中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；(c3)用于检测待测菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。本专利技术还保护含有所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c2)或(c3)：(c2)用于检测待测样本中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；(c3)用于检测待测菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。本专利技术还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本专利技术还保护一种检测待测菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待测菌的基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：如果采用所述引物组合可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌为或候选为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；如果采用所述引物组合不可以实现以所述基因组DNA为模板的特异性扩增，待测菌不为或候选不为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。本专利技术还保护一种检测待测样本中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：(1)提取待测样本的总DNA；(2)以步骤(1)提取的总DNA为模板，采用所述引物组合进行环介导等温扩增，然后进行如下判断：如果采用所述引物组合可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中含有或疑似含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；如果采用所述引物组合不可以实现以所述总DNA为模板的特异性扩增，待测样本中不含有或疑似不含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。以上任一所述方法中，采用所述引物组合时，所述环介导等温扩增的反应体系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩尔浓度依次为0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。以上任一所述方法中，环介导等温扩增反应条件为：65℃恒温50min。本专利技术还保护所述引物组合在检测待测菌是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。本专利技术还保护所述引物组合在检测待测样本中是否含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。以上任一所述耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具体可为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌TR558(Ling-XiangZhu，Zhi-WeiZhang，atal.UseofaDNAMicroarrayforSimultaneousDetectionofAntibioticResistanceGenesamongStaphylococcalClinicalIsolates.JOURNALOFCLINCALMICROBIOLOGY，Nov.2007，p.3514-3521.)。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测常见的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。本专利技术提供的引物组合用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快本文档来自技高网...

【技术保护点】
引物组合，由引物Ⅰ‑F3、引物Ⅰ‑B3、引物Ⅰ‑FIP、引物Ⅰ‑BIP、引物Ⅰ‑LF和引物Ⅰ‑LB组成；所述引物Ⅰ‑F3为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物Ⅰ‑B3为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物Ⅰ‑FIP为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物Ⅰ‑BIP为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物Ⅰ‑LF为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物Ⅰ‑LB为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。...

【技术特征摘要】
1.引物组合，由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；所述引物Ⅰ-F3为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；所述引物Ⅰ-B3为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；所述引物Ⅰ-FIP为如下(a5)或(a6)：(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；所述引物Ⅰ-BIP为如下(a7)或(a8)：(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；所述引物Ⅰ-LF为如下(a9)或(a10)：(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；(a10)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；所述引物Ⅰ-LB为如下(a11)或(a12)：(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；(a12)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。2.权利要求1所述引物组合在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c2)或(c3)：(c2)用于检测待测样本中是否含有耐甲氧西林金...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，王颢婷，刘莹莹，邢婉丽，程京，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11