一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用。所述调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述长链脂肪酸转运蛋白Fat1p，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术首次发现热带假丝酵母中的长链脂肪酸转运蛋白基因fat1p为长链脂肪酸的跨膜转运过程中的关键基因，其表达可以促进长链脂肪酸由胞外到胞内的跨膜转运，为以油脂为原料实现新途径合成长链二元酸打下基础。

【技术实现步骤摘要】
一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用
本专利技术涉及一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用，属于生物工程

技术介绍
长链二元酸一般是指碳链中含有10个以上碳原子的直链脂肪族二元羧酸。该产品具有较高的工业应用价值，可以用于合成特种尼龙、高级麝香、粘合剂、热熔胶、医药、农药等重要的化工中间体。目前国内外生产长链二元酸主要有2种方法：化学法和发酵法。与微生物发酵法相比，化学法生产长链二元酸条件苛刻、工艺复杂、不够环保，且产品质量差，因此众多研究者将目标转向有广阔发展前景、工业价值大的微生物发酵上来。微生物发酵法是以正构烷烃为原料，利用热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)的氧化性能，在常温常压下氧化正构烷烃两端的甲基，生成基质烷烃相应链长的二元酸。国内已经实现了以烷烃为底物发酵生产长碳链二元酸的产业化，生物法制备得到十一至十四碳二元酸已投放市场。如中国专利文献CN1570124A(申请号2004100182557)、中国专利文献CN1844404A(申请号CN200610038331X)、中国专利文献CN101225411A(申请号2007101958427)、中国专利文献CN102115769A(申请号2009102565907)、中国专利文献CN102115768A(申请号2009102565890)、中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)、中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)、中国专利文献CN102061316A(申请号2010101603101)和中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)等。目前微生物发酵法生产长链二元酸的技术特别是微生物育种方面日趋成熟，如中国专利文献CN105400796A(申请号201511003830)则公开了一种热带假丝酵母定位于过氧化物酶体膜上的长链脂肪酸转运蛋白基因pxa1p，并通过基因工程阻断该基因的合成实现长链二元酸产量的提升。中国专利文献CN103992959A(申请号2014101755564)通过增加一个拷贝的CYP单加氧酶基因提高热带假丝酵母长链二元酸的产率，中国专利文献CN102839133A(申请号CN201110168672X)则菌种诱变育种筛选到一株pox4基因、fao基因和CYP52A18基因的突变株，突变株对不同碳链长度的烷烃、脂肪酸等物质具有很高的转化性能。但随着石油资源的枯竭，以烷烃为原料生产长链二元酸面临日益严重的成本压力和原料压力。因此，寻找可再生的、廉价的烷烃替代品作为原料，成为长碳链二元酸产业所面临的重大挑战。采用油脂为原料生产长链二元酸，可以大大降低原料成本，与国外化学合成法、国内利用石油生物发酵生产二元酸相比，节省了能源类原料，预计生产成本下降20％以上。虽然以油脂为原料生产长链二元酸能够有效节约成本，并且为油脂特别是回收油脂的资源化利用开辟了一条新途径，但由于目前长链二元酸生产菌株均利用烷烃为底物进行发酵，而对油脂的吸收和利用效率较低，因而寻找新的途径提高热带假丝酵母吸收油脂的效率势在必行。在酵母的生活周期中，油脂需要在胞外环境中被脂肪酶分解为甘油和脂肪酸后才能被细胞吸收利用，而目前对酵母吸收转运脂肪酸的详尽机制还不十分明确。Stahl(2004)提出，在酿酒酵母中FAT/CD36可能把长链脂肪酸(longchainfattyacids,LCFAs)传递给FATP转运进入细胞。进入细胞的LCFAs被FATP激活形成乙酰CoA，然后与细胞质结合蛋白(acyl-coenzymeA-bindingprotein,ACBP)结合，参与甘油三酯的合成。其它LCFAs和细胞质结合蛋白或FABP结合，转运至细胞内代谢需要的位点(Pohl等，2004)，而在热带假丝酵母中尚未有相关转运蛋白被报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用。本专利技术技术方案如下：一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p来源于热带假丝酵母，定位于热带假丝酵母细胞膜上，其表达可以促进长链脂肪酸由胞外到胞内的跨膜转运。一种长链脂肪酸转运蛋白Fat1p，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。上述调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p在改造热带假丝酵母制备长链二元酸中的应用。根据本专利技术优选的，所述应用，通过构建长链脂肪酸转运的基因fat1p的多拷贝重组假丝酵母或更换启动子实现长链脂肪酸转运的基因fat1p的过量表达。通过构建长链脂肪酸转运的基因fat1p的多拷贝重组假丝酵母或更换启动子实现长链脂肪酸转运的基因fat1p的过量表达，从而可以提高热带假丝酵母胞外长链脂肪酸向胞内转运速率，增加长链二元酸合成原料长链脂肪酸的供给，进而提高热带假丝酵母长链二元酸的产量。有益效果本专利技术首次发现热带假丝酵母中的长链脂肪酸转运蛋白基因fat1p为长链脂肪酸的跨膜转运过程中的关键基因，其表达可以促进长链脂肪酸由胞外到胞内的跨膜转运，为以油脂为原料实现新途径合成长链二元酸打下基础。附图说明图1、同源臂Fat1p1电泳结果照片；图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为同源臂Fat1p1；图2、G418抗性基因片段Kan电泳结果照片；图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为G418抗性基因片段Kan；图3、重叠片段Fat1p1-kan电泳结果照片；图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为重叠片段Fat1p1-kan；图4、酵母基因组PCR验证电泳结果照片；图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为重叠片段Fat1p1-kan；图5、热带假丝酵母原始菌和热带假丝酵母重组菌生长曲线图；图6、实施例3通过PCR扩增获得Fat1p基因的电泳照片；图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为Fat1p基因；图7、实施例3采用菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子的结果照片；图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为Fat1p基因；图8、实施例3电转入热带假丝酵母感受态后的鉴定结果照片；图中：泳道1、泳道2、泳道3、泳道4均为G418抗性基因片段Kan；图9、热带假丝酵母重组菌油脂利用能力曲线图；具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案做进一步阐述，但本专利技术所保护范围不限于此。生物材料来源：质粒pPIC9K购自宝生物有限公司；热带假丝酵母(Candidatropicalis)购自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；编号为CICC1798；实施例1热带假丝酵母长链脂肪酸基因的查找及分析目前关于长链脂肪酸转运蛋白的研究非常少，已知仅酿酒酵母中存在特殊的长链脂肪酸转运蛋白负责长链脂肪酸的跨膜转运，而热带假丝酵母中类似基因尚未被报道。以酿酒酵母fat1p基因为模板在NCBI数据库查询可知，热带假丝酵母基因组中存在相似基因序列，其序列如SEQIDNO.1所示，所编码的蛋白质与酿酒酵母中的fat1p序列一致性为59.7％，推测其与长链脂肪酸转运有关。实施例2热带假丝酵母fat1p基因功能的验证1、热带假丝酵母基因工程本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因fat1p，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种长链脂肪酸转运蛋白Fat1p，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转...

【专利技术属性】
技术研发人员：王瑞明，石莹，汪俊卿，杨晓慧，程成，彭健，修翔，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37