手足口病病毒等温扩增检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，旨在提供一种操作简便、灵敏快捷的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒；其技术要点包括：1）等温扩增反应液、阳性质控标准品，和2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒；所述的等温扩增反应液由等温扩增缓冲液、反应酶、正、反向引物、分子信标组成；其中：正向引物的碱基序列为ACACAGGTGAGCAGTCATCG；反向引物的碱基序列为AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT；分子信标的碱基序列为CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGG，3）可用于荧光定量PCR仪的实时检测和手持式荧光检测仪的终点检测。

【技术实现步骤摘要】
手足口病病毒等温扩增检测试剂盒
本专利技术公开了一种测试手足口病的剂盒，具体地说，是一种检测手足口病病毒EV71的等温扩增试剂盒。
技术介绍
肠道病毒71型（英文名为：Humanenterovirus71），简称EV71，是引起婴幼儿手足口病主要病原体之一，EV71以其高致病性、高死亡率夺去了很多人的生命，根据中国疾病预防控制中心公布的统计数据表明，自2009年以来，手足口病发病率和死亡率呈逐年上升趋势，并连续3年成为我国丙类传染病发病率和死亡率最高的疾病。诊断、治疗和预防是应对和处置重要传染病的三个关键环节，而早期诊断最为关键，是有效治疗的基础，也是制定预防策略的依据，因此开发针对EV71病毒的快速诊断试剂盒就显得尤为迫切和重要。现有的快速检测技术主要有两类：第一类为免疫学方法，包括酶联免疫吸附法、免疫荧光法、同位素标记抗体法、乳胶凝集法、免疫传感器法、免疫扩散法及免疫色谱法等；第二类是以核酸为基础的分子生物学方法，主要有核酸探针法和聚合酶链反应法（PolymeraseChainReaction，PCR）。其中的PCR方法是核酸扩增技术的典型代表，该技术是由美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullin等人于1985年专利技术的，在过去的二十年里，PCR技术作为分子生物学的核心得到了迅猛的发展和应用，特别是在疾病的临床诊断中，PCR技术以其快速、灵敏和特异的优势，不仅日益取代了传统的诊断方法，而且使以往无法完成的诊断成为了可能。尽管PCR技术长期以来占据着核酸扩增垄断技术的地位，新近研发的一系列等温核酸扩增检测技术正逐渐成为PCR技术的替代技术而被广泛应用。与PCR技术相比，核酸等温扩增技术的特点是可在特定温度条件下实现核酸的扩增。由于扩增反应的全过程均在同一温度下进行，使它们对仪器的要求大大简化，可通过加热模块、水浴槽等简单的，甚至是非专业的设备完成反应。目前常用的等温技术有以下几类：1、依赖核酸序列扩增（Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）2、自主序列复制（Self-sustainedSequenceReplication，3SR）3、转录介导扩增（Transcriptionmediatedamplification，TMA）4、单引物等温扩增技术（SinglePrimerIsothermalAmplification，SPIA）5、滚环扩增技术（rollingcircleamplification，RCA）6、环介导的等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）7、链替代扩增技术（Stranddisplacementamplification，SDA）这些核酸扩增技术（PCR技术、等温扩增技术等）的扩增产物为DNA或RNA，与之相对应的扩增产物检测方法主要有以下几种：电泳分析：常规变性凝胶电泳后用EB或SYBRGreenⅠ染色，在1%-1.5%琼脂糖凝胶中可以轻易识别。目前该方法已很少使用；杂交技术：产物通过与特异性探针标记的序列杂交，如32P标记的寡核苷酸序列与扩增产物进行Northern杂交以检测扩增产物；酶联凝胶（enzyme-linkedgelassay，ELGA）技术：用非放射性的辣根过氧化物酶（HRP）标记的探针检测扩增产物。未杂交的探针通过在垂直凝胶电泳中得以分离，然后将凝胶置于有HRP底物的溶液中孵育，则可目测反应结果；电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）技术：5’端标记有生物素的捕获探针将扩增产物固定在链霉亲和素结合的磁珠上，下游引物的5’末端含有和钉标电化学发光检测探针互补的序列。扩增产物与ECL探针形成复合物，携带该复合物的磁珠被电极的表面磁性捕获。电极上的电压引起电化学发光（ECL）反应。已杂交上的钉标磁珠发出的光和扩增反应产生的RNA扩增产物总量成比例对应，由此可以对扩增产物进行检测和定量；分子信标技术：分子信标是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET）现象设计的。分子信标为一茎环结构的寡核苷酸探针，其环状区核苷酸序列长度一般为15～30个碱基，能与目标序列互补，靠近两端的部分序列构成分子信标的茎干区，大约有6-8个碱基对，两端分别标记荧光基团（fluorophore）和淬灭基团（quencher）。没有目标序列存在时，分子信标保持茎环结构，荧光基团与淬灭基团靠近，此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被猝灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当目标序列存在时，分子信标与序列完全互补的靶序列结合形成双链杂交体时，信标茎干互补区被拉开，荧光基团和猝灭基团距离增大，荧光产生。在核酸扩增体系中应用分子信标可随着扩增的进行，均一地产生荧光信号，使分子信标的环状序列不断与扩增子杂交产生荧光信号进行实时检测。分子信标中常用4-（4’-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团，德克萨斯红（TexasRed）、荧光素（Fluoresein）等作为荧光基团。其中，基于T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、分子信标及RNA酶H的NASBA等温扩增技术因其灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时测定而得到了一定的运用。但是目前的NASBA等温扩增结果检测需要在价格昂贵的荧光定量PCR仪上进行，目前我国装备有大型荧光定量PCR仪的实验室及医院有限，不能满足口岸、基层和偏远地区对于EV71病毒检测的需求。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术的目的在于提供一种操作简便、价格低廉的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案是这样的：一种足口病病毒等温扩增检测试剂盒，包括：1）等温扩增反应液、阳性质控标准品，和2）分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒；所述的等温扩增反应液由等温扩增缓冲液、反应酶、正、反向引物、分子信标组成；其中：所述的正向引物的碱基序列为SEQIDNo.1：ACACAGGTGAGCAGTCATCG；所述的反向引物的碱基序列为SEQIDNo.2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT；所述的分子信标的碱基序列为SEQIDNo.3：CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGG。上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的等温扩增缓冲液包括TrisHCl40mM、KCl70mM，MgCl212mM，DTT10mM，dNTP1mM，rNTP2mM，山梨糖醇375mM。上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的反应酶由T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNA酶H组成。上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的阳性质控标准品为重组质粒pET-32a。上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的阳性质控标准品的浓度为105copies/反应～102copies/反应。上述的手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，所述的T7RNA聚合酶的酶活力32U，AVM聚合酶的酶活力6.4U、RNA酶H的酶活力0.08U。上述的手足口病病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种手足口病病毒等温扩增检测试剂盒，包括：1)等温扩增反应液、阳性质控标准品，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒；其特征在于，所述的等温扩增反应液由等温扩增缓冲液、反应酶、正、反向引物、分子信标组成；其中：所述的正向引物的碱基序列为SEQIDNo.1：ACACAGGTGAGCAGTCATCG；所述的反向引物的碱基序列为SEQIDNo.2：AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAAGTCTCAATCATGCTCTCATCACT；所述的分子信标的碱基序列为SEQIDNo.3：CCTTGGACAGGTAAGGTTCCAGCACTCCAAGG；所述的等温扩增缓冲液包括TrisHCl40mM、KCl70mM，MgCl212mM，DTT10mM，dNTP1mM，rNTP2mM，山梨糖醇375mM；所述的反应酶由T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶、RNA酶H组成；所述的阳...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭涛，龙飞，苏文瀚，肖静，殷仙丽，卢然如，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，佛山市烨泰科技有限公司，
类型：发明
国别省市：