本发明专利技术涉及一种利用荧光PCR技术检测人白介素28B（IL28B）基因多态性的试剂盒。它在单个反应管中采用3条引物扩增rs12979860基因CC型和TT型序列，通过2条不同波长MGB荧光探针检测该基因的CC型和TT型。试剂盒操作简便、检测结果准确可靠，可应用于临床丙型肝炎患者IL28Brs12979860基因多态性检测，进而预测抗病毒药物治疗效果。
【技术实现步骤摘要】
一种人白介素28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒
本专利技术涉及医学分子生物学领域，具体涉及一种人白介素28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒。
技术介绍
人白介素28B基因（Interleukin28B，IL28B）位于人第19号染色体短臂（19q13），编码干扰素λ3（INF-λ3）参与人体抗病毒免疫反应，IL28B能刺激干扰素释放，增加细胞毒性T淋巴细胞数量，目前研究表明IL28B基因上游约3kb附近的单核苷酸多态性（SNP）rs12979860与聚乙二醇干扰素、利巴韦林联合治疗丙型肝炎的效果显著（TanakaY,etal，NatGenet，2009，41:1105-1109），其中rs12979860多态性CC型比CT杂合型、TT型丙型肝炎或者的病毒清除率高2～3倍、且CC型比非CC型丙型肝炎患者获得显著增高的持续病毒反应与治疗终末反应（JHepatol，2011，55：692-701；Nature，2009，461：798-801；AntivirTher，2011，16：141-47）。因此，丙型肝炎患者在抗病毒治疗前，检测与确定IL28Brs12979860基因多态性亚型，可以预测抗病毒药物疗效，有助于临床选择治疗方案，如选择抗病毒药物的种类和决定治疗持续的时间，同时还可用于肝移植前的供体筛查、复发性丙型肝炎患者的管理。基因测序是检测IL28Brs12979860基因多态性的金标准方法，但是具有操作技术要求高、检测灵敏度低、不能区分杂合型的缺点，近年来也有利用等位基因特异性PCR（AS-PCR）、实时荧光PCR技术、熔解曲线或高分辨率熔解曲线分析（HRM）方法检测IL28Brs12979860基因多态性的文献报道（JMolecularDiagnostics，2011，13(4)：446-51；JClinMicrobiol，2012：50：3353-55；中华检验医学杂志，2013，36(1)：59-62和36(8)：722-26），其中AS-PCR需要用凝胶电泳观察条带大小判断结果，检测灵敏度低、操作不方便；文献报道的荧光PCR检测或者采用单波长分管检测不同rs12979860基因亚型、操作复杂，或者使用单管检测但存在不同亚型交叉影响的问题，而HRM分析对仪器要求较高，多态性检测结果受仪器影响，这些检测方法存在的不足限制了IL28Brs12979860基因多态性检测在临床上的应用。
技术实现思路
本专利技术提供一种单管检测人白介素28B基因（IL28B）多态性的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用3条引物扩增IL28Brs12979860基因CC型和TT型序列，通过2条不同波长MGB荧光探针检测该基因的CC型和TT型；3条引物具有SEQIDNO：1～3的序列，2条荧光探针具有SEQIDNO：4和5的序列，SEQIDNO：4序列探针5’端标记FAM荧光基团、SEQIDNO：5序列探针5’端标记JOE或HEX或VIC荧光基团，探针3’端均标记MGB-NFQ基团；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。本专利技术通过双波长TaqManMGB探针荧光PCR技术实现单管检测IL28Brs12979860基因多态性，区分CC型、TT型以及杂合型，试剂盒使用简便、检测结果准确可靠，可应用于临床丙型肝炎患者IL28Brs12979860基因多态性检测，进行抗病毒治疗效果预测。技术方案通过对GenBank中人IL28Brs12979860基因序列查询，用VectorNTI、Oligo等软件对基因序列进行比对设计，按照TaqManMGB荧光PCR设计的原则，优选了2条上游引物和1条下游引物扩增rs12979860基因CC型和TT型核苷酸序列中的66bp片段、2条MGB探针分别检测该基因的CC型、TT型。上述引物探针设计具有如下特点：具有SEQIDNO：1和2序列的2条上游引物3’端末尾1～3个核苷酸位置设计了rs12979860基因单核苷酸突变位点，分别配合共有下游引物扩增CC型和TT型序列；具有SEQIDNO：4和5序列的2条MGB探针3’端1～5个核苷酸分别与上游引物SEQIDNO：1和2的3’端序列互补重叠，对应检测CC型和TT型。3条引物和2条MGB荧光探针核苷酸序列（5’->3’）如下：CC型上游引物（CCpf）：gAgCTCCCCgAAggCgCg，序列记为SEQIDNO：1。TT型上游引物（TTpf）：gAgCTCCCCgAAggCgTg，序列记为SEQIDNO：2。下游共有引物（pr）：ggCgAggggCTTTgCTgg，序列记为SEQIDNO：3。CC型荧光探针（CCprobe）：CAATTCAACCCTggTTCgC，序列记为SEQIDNO：4，其中探针5’端标记FAM（6-carboxy-fluorescein）荧光基团、3’端标记MGB-NFQ（Minorgroovebinder-nonfluorescentquencher）淬灭基团。TT型荧光探针（TTprobe）：CAATTCAACCCTggTTCACg，序列记为SEQIDNO：5，其中探针5’端标记JOE（5-dichloro-dimethoxy-fluorescein）或HEX（5-hexachloro-fluorescein）或VIC荧光基团、3’端标记MGB-NFQ淬灭基团。上述引物探针序列也可以是和SEQIDNO：1～5序列同源性大于85%以上的序列。所述荧光PCR反应体系各成分组成如下：Tris-HCl（pH8.3）10mM、KCl50mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2mM、MgCl23mM、3条引物各0.8μM、2条MGB荧光探针各0.2μM、TaqDNA聚合酶2U、UNG酶0.5U，提取的模板10μl，总反应体积30μl。所述荧光PCR扩增程序如下：50℃2min、95℃10min后按照95℃10sec、62℃35sec循环扩增40次，循环步骤中62℃时采集FAM和JOE波长荧光信号。所述人IL28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒质控品包括阴性对照、CC型阳性对照、TT型阳性对照各1个，其中阴性对照为去离子水，CC型、TT型阳性对照分别为人工构建含有IL28Brs12979860基因CC型、TT型扩增片段的TA克隆质粒，浓度为105copy/ml。通过上述设计优选获得的3条扩增引物和2条荧光探针，本专利技术提供了实时荧光PCR检测的试剂盒，优化了PCR反应体系和扩增程序。当然本研究领域技术人员根据荧光PCR的一般要求可以调整PCR反应体系和程序，也同样能实现检测的目的。有益效果本专利技术根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成人IL28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒，其主要特点如下：（1）通过型特异性的引物探针特殊重叠设计，提高了试剂盒检测的特异性。（2）通过反应体系和扩增程序优化，在两种基因型扩增效率和非特异扩增之间获得平衡，提高了试剂盒检测的准确性，避免因结果不准确造成误诊。（3）试剂盒实现了单管检测IL28Brs12979860基因多态性，使用简便快速，可在2小时内报告检测结果。（4）试剂盒扩增体系中的dUTP－UNG酶系统避免了本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种单管检测人白介素28B基因（IL28B）多态性的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用3条引物和2条MGB荧光探针检测该基因rs12979860的CC型和TT型，并且3条引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1～3，2条荧光探针核苷酸序列分别为SEQ ID NO：4和5，SEQ ID NO：4序列探针5’端标记FAM荧光基团、SEQ ID NO：5序列探针5’端标记JOE或HEX或VIC荧光基团，两条探针3’端均标记MGB‑NFQ淬灭基团；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。
【技术特征摘要】
1.一种单管检测人白介素28B基因多态性的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用3条引物和2条MGB荧光探针检测该基因rs12979860的CC型和TT型，并且3条引物核苷酸序列分别为SEQIDNO：1～3，2条荧光探针核苷酸序列分别为SEQIDNO：4～5，SEQIDNO：4序列探针5’端标记FAM荧光基团、SEQIDNO：5序列探针5’端标记JOE或HEX或VIC荧光基团，两条探针3’端均标记MGB-NFQ淬灭基团。2.如权利要求1所述的试剂盒，使用的3条引物中有2条上游引物SEQIDNO：1和SEQIDNO：2、1条下游引物SEQIDNO：3，人白介素28B基因rs12979860基因单核苷酸突变位点设计在上游引物SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的3’端末尾1～3个核苷酸位置，辅以共有的下游引物SEQIDNO：3分别扩增CC型和TT型。3.如权利要求1所述的试剂盒，...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴大治，夏懿，吴梅，
申请(专利权)人：上海星耀医学科技发展有限公司， 上海复星医药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。