可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法制造技术

本发明专利技术涉及一种双探针实时荧光定量PCR方法，更具体涉及一种可区分HBVB型和非B型的双探针实时定量PCR法。本发明专利技术建立了一种基于型特异性碱基设计的双探针实时定量PCR法，适用于B、C基因型流行的亚洲和太平洋地区HBV感染者HBV核酸定量的同时进行粗略基因分型，并且避免了其他少见基因型的漏检。该方法包括以下步骤：（1）设计保守引物，及针对B型和非B型的Taqman探针；（2）提取血清样本中HBVDNA；（3）双探针实时荧光定量PCR,同时对HBVDNA进行分型和定量。本发明专利技术建立的双探针实时定量PCR法准确、灵敏、特异、重复性好，可以同时进行HBVDNA的定量检测和基因分型，适合于临床推广。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种双探针实时荧光定量PCR方法，更具体涉及一种可区分HBVB型和非B型的双探针实时定量PCR法。本专利技术建立了一种基于型特异性碱基设计的双探针实时定量PCR法，适用于B、C基因型流行的亚洲和太平洋地区HBV感染者HBV核酸定量的同时进行粗略基因分型，并且避免了其他少见基因型的漏检。该方法包括以下步骤：（1）设计保守引物，及针对B型和非B型的Taqman探针；（2）提取血清样本中HBVDNA；（3）双探针实时荧光定量PCR,同时对HBVDNA进行分型和定量。本专利技术建立的双探针实时定量PCR法准确、灵敏、特异、重复性好，可以同时进行HBVDNA的定量检测和基因分型，适合于临床推广。【专利说明】可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法
本专利技术涉及一种双探针实时荧光定量PCR方法，更具体涉及一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法。
技术介绍
乙型肝炎病毒感染严重威胁着人类的健康，可引起急慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌等肝脏疾病。目前全球有超过3.5亿的慢性HBV感染者，每年死于HBV感染所致的终末期肝病和肝癌的人数超过100万人，快速、准确地诊断乙型肝炎对于其治疗及预后有着重要意义。
技术实现思路
外周血HBVDNA的存在是诊断HBV感染最直接可靠的指标，也是慢性乙型肝炎诊断和治疗过程中重要的监测项目。当前，HBV依据其基因组异质性≥8%至少可以分为A~I9个基因型，不同的基因型呈显著的地域性分布，在HBV高度流行的亚洲和太平洋地区以B基因型和C基因型为主，兼有少量的其他基因型(例如D型)。近年来，研究表明不同的基因型和疾病的进展、抗病毒治疗的效果及临床预后有一定的相关性，B基因型感染者比C基因型感染者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为肝硬化和肝癌，而且对干扰素治疗的应答率较高。因此，在亚太地区，将B基因型和非B基因型区分开来对于HBV感染后疾病进展的风险预测和治疗方案的选择具有重要意义。更重要的是，在进行抗病毒治疗的患者中发现了 “基因型漂移”的现象，可能与机体的免疫状况和药物抗病毒压力有关。因此，在监测患者体内HBV DNA的量的变化的同时有必要实时监测HBV基因型，这样可以更好地动态地指导抗病毒治疗，及时调整治疗方案，也可以更好地预测预后及转归。目前，HBV DNA定量主要有实时PCR、分子杂交定量等方法，HBV基因分型主要有测序法、PCR-RFLP等方法。其中测序法是基因分型的“金标准”，但其价格较贵，对混合型的检出能力较差，限制了其在临床上的广泛应用；此外，如果分别进行HBV DNA定量检测和基因分型，既费时、费力，又增加患者负担。鉴于此，本专利技术建立了一种基于型特异性碱基设计的双探针实时定量PCR法，适用于B、C基因型流行的亚洲和太平洋地区HBV感染者HBV核酸定量的同时进行粗略基因分型，并且避免了其他少见基因型的漏检。
技术实现思路
基于上述目的，本专利技术建立了一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法。本专利技术采取的技术方案如下: 一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法，包括以下步骤:(I)通过对已明确基因型的HBV全基因组序列进行比对，选择保守区设计保守引物，即上游引物F和下游引物R，同时选择型特异性碱基聚集区设计针对B型和非B型的Taqman探针，其中B型探针5'端标记Hex荧光基团，非B型探针5'端标记FAM荧光基团，两者3'端均标记猝灭基团；(2)提取血清样本中HBV DNA ; (3)双探针实时荧光定量PCR:保守引物能扩增所有基因型HBV DNA，而B型探针只能结合B基因型HBV DNA，非B型探针能结合余下所有基因型HBVDNA,然后在PCR反应进行时，Taqman探针被Taq酶水解而发出荧光，通过监测扩增曲线，并记录荧光阈值，同时对HBV DNA进行分型和定量。所述双探针实时荧光定量PCR的反应体系:2XPremix Ex Taq 10μ l,20ymol/L 上游引物 F 0.2 μ 1，20 μ mol/L 下游引物 R 0.2 μ 1，20 μ mol/L B 型探针 0.3 μ 1，20μ mol/L 非 B 型探针 0.3 μ 1，50XR0X 0.4 μ 1，模板 2μ 1，ddH20 6.6 μ 1，总体积 20μ I ;反应条件:95°C 30s — 95°C 5s, 60°C 30s 40个循环，在60°C选择Hex和FAM通道采集荧光信号，分别代表B基因型和非B基因型扩增，结果用ABI StepOne plus软件确定各样品的循环阈值。上述涉及的引物如下: 上游引物FCTAGACTCGTGGTGGACTTCTC, 下游引物RATGAGGCATAGCAGCAGGAT， B型探针 非B型探针 以B基因型质粒作为B型扩增的标准品，C基因型质粒作为非B型扩增的标准品，分别绘制B基因型和非B基因型标准曲线，通过标准曲线对未知样品定量；同时对HBV DNA进行分型，若仅在Hex通道检出红色扩增曲线为B基因型，若仅在FAM通道检出绿色扩增曲线为非B基因型；若同时在Hex和FAM通道检出扩增曲线为混合基因型。为了测试本专利技术的实用性，本 申请人:做了一系列有益的试验如下: 1.双探针实时荧光定量PCR法的建立 选择保守区设计引物，选择型特异性碱基聚集区设计针对B基因型和非B基因型的Taqman探针，建立能在I个反应体系能够对HBV DNA进行定量并区分B基因型和非B基因型的方法。2.双探针实时荧光定量PCR法的方法学评价 评价双探针实时荧光定量PCR法的线性范围、检测下限、灵敏度、特异性、重复性等指标。3.双探针实时荧光定量PCR法检测效能评价及其初步临床应用 以凯杰公司HBV DNA核酸定量检测试剂盒作为HBV DNA定量参照方法，申友公司HBV基因分型试剂盒为HBV基因分型参照方法，同双探针实时荧光定量PCR法平行检测539例HBV感染者血清标本，评价本专利技术方法定量和分型的准确性。其结果如下: 1.成功建立双探针实时荧光定量PCR法 本专利技术的双探针实时荧光定量PCR法能够对HBV DNA进行定量并且能够区分B基因型和非B基因型HBV。在Hex通道检出典型扩增曲线为B基因型；在FAM通道检出典型扩增曲线为非B基因型；同时在Hex和FAM通道检出典型扩增曲线为混合基因型。2.双探针实时荧光定量PCR法方法学评价双探针实时荧光定量PCR法检测B、非B基因型的灵敏度均为500kIU/L ;线性范围均为IO3~IO9 IU/ml ;混合基因型达到10%时就能检测出来；批内和批间CT在0.84%~2.80%之间；对其他病毒感染者和健康志愿者血清检测结果均为阴性。3.双探针实时荧光定量PCR法检测效能评价及其初步临床应用 509例HBV DNA阳性检测结果，基因分型结果与HBV测序分型试剂盒总符合率为93.5%(476/509，Aappa=0.876，P<0.05) ；DNA定量结果与凯杰HBV核酸定量测定试剂盒定量结果有很好的相关性(f=0.94，P<0.05)，且经Bland-Altman分析，95.7% (487/509)的值在95% 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可区分HBV B型和非B型的双探针实时定量PCR法，其特征在于：包括以下步骤：（1）通过对已明确基因型的HBV全基因组序列进行比对，选择保守区设计保守引物，即上游引物F和下游引物R，同时选择型特异性碱基聚集区设计针对B型和非B型的Taqman探针，其中B型探针5′端标记Hex荧光基团，非B型探针5′端标记FAM荧光基团，两者3′端均标记猝灭基团；（2）提取血清样本中HBV DNA；（3）双探针实时荧光定量PCR：保守引物能扩增所有基因型HBV DNA，而B型探针只能结合B基因型HBV DNA，非B型探针能结合余下所有基因型HBV DNA，然后在PCR反应进行时，Taqman探针被Taq酶水解而发出荧光，通过监测扩增曲线，并记录荧光阈值,同时对HBV DNA进行分型和定量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：欧启水，王炜，曾勇彬，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：福建;35