【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种构建基于irfp基因金黄色葡萄球菌菌株的引物、构建及应用，应用在体内示踪金黄色葡萄球菌菌株构建领域。
技术介绍
1、为了研究不同疾病的发病机制等，一般需要建立不同的动物模型用以观察体内的动态发展。既往的体内动物模型中，为了观察病变部位的变化需要处死实验动物并取出病理组织，感染模型需要经过一系列后处理，接种至培养介质复苏，再进行细菌菌落计算，也没有办法同时观察炎症情况与细菌密度的相关性。肿瘤动物模型需要取出肿瘤部分进行冷冻切片，he染色等观察肿瘤组织病变情况等，在一次动物体内实验中将通过不断重复牺牲大量模型动物来收集实验数据。这些方法不仅需要耗费较长时间，繁琐重复的操作也使得实验低效率化。所以，开发一种可以无创性实时监测模型动物体内动态性变化过程的方法尤为重要。
2、荧光蛋白(fp)在哺乳动物中有着重要的应用价值，可以无创地追踪体内细胞基因及蛋白的表达，细胞的定位；也可用于追踪体内肿瘤细胞的转移、生长，抗肿瘤药物使用情况或者细菌感染。
3、体内荧光成像主要有两种方法：生物发光(bioluminescence bli)和荧光成像(fluorescence)。前者是用荧光素酶(luciferase)基因标记细菌，利用产生的荧光素酶与相应底物发生生化反应从而产生生物发光信号，无需激发光源，可通过高度灵敏的电荷耦合器件(ccd)直接捕捉生物体自身发光信号；而后者则是采用荧光报告基因(如gfp、rfp)进行标记，利用外界激发光源的激发捕捉荧光蛋白产生的体内荧光信号。
4、传统的荧光蛋白标
5、与irfp相比，荧光素酶的最大发射波长小于irfp的最大波长，同时需要注射荧光底物并利用高精度仪器进行成像。而且它作为一种酶，对环境条件要求较高，比如充足的氧气、水、能量、温度等才能发挥最大的发光效应，且由于需要注射荧光底物，有一定的细胞毒性，所以细胞的生长状况也需要进行考虑，实验过程中容易受到外界条件的干扰。
6、现有技术中虽有基于irfp720近红外荧光蛋白和cre-loxp基因构建在海马体区域特异性敲除ikkα基因的小鼠模型的方法(cn201610810333.x)，但其只能研究特定的基因表达情况且操作繁琐。
7、因此，提供一种可用于无创地体内示踪，适用广泛且成本低、操作简单的构建基于irfp基因金黄色葡萄球菌菌株的引物、构建及应用己成为当务之亟。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中没有适用广泛、操作简单且成像深度好的可用于无创地体内示踪的菌株的缺点，本专利技术提供一种构建基于irfp基因金黄色葡萄球菌菌株的引物、构建及应用，通过采用特别设计的7对引物，实现基于irfp基因金黄色葡萄球菌菌株的构建，具有适用广泛、操作简单、可无创地体内示踪以及成像深度好的优点。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种构建基于irfp基因的金黄色葡萄球菌菌株的引物，其特征在于：包括以下7对引物：sqr-up-f、sqr-down-r，sqr-irfp-f、sqr-irfp-r，irfp-sqr-f、irfp-sqr-r，sqr-pkor1-f、sqr-pkor1-r，pkor1-sqr-f、pkor1-sqr-r，sqr-jd-f、sqr-jd-r，irfp-f、irfp-r；
4、其中，引物sqr-up-f的序列如seq id no:1所示，引物sqr-down-r的序列如seq idno:2所示，引物sqr-irfp-f的序列如seq id no:3所示，引物sqr-irfp-r的序列如seq idno:4所示，引物irfp-sqr-f的序列如seq id no:5所示，引物irfp-sqr-r的序列如seq idno:6所示，引物sqr-pkor1-f的序列如seq id no:7所示，引物sqr-pkor1-r的序列如seq idno:8所示，引物pkor1-sqr-f的序列如seq id no:9所示，引物pkor1-sqr-r的序列如seq idno:10所示，引物sqr-jd-f的序列如seq id no:11所示，引物sqr-jd-r的序列如seq id no:12所示，引物irfp-f的序列如seq id no:13所示，引物irfp-r的序列如seq id no:14所示。
5、所述构建基于irfp基因金黄色葡萄球菌菌株的引物，通过采用特别设计的7对引物，实现基于irfp基因金黄色葡萄球菌菌株的构建，具有适用广泛、操作简单、可无创地体内示踪以及成像深度好的优点。利用该基于irfp基因金黄色葡萄球菌菌株可以无创地标记并追踪体内细胞基因及蛋白的表达、细胞的定位；也可用于追踪体内肿瘤细胞的转移、生长、抗肿瘤药物使用情况或者细菌感染。相比于传统的gfp标记或是荧光素酶标记，此基于irfp基因金黄色葡萄球菌菌株有更长的发射波长，能进行更深层组织的成像，由于无需注射荧光底物，没有细胞毒性，对细胞和环境条件的要求更低，同时实验成本低廉，操作简单。
6、所述的构建基于irfp基因的金黄色葡萄球菌菌株的引物，还包括以下2对引物：irfp-kpni-f、irfp-ecori-r，prn12-jd-f、prn12-jd-r；其中，引物irfp-kpni-f的序列如seq id no:15所示，引物irfp-ecori-r的序列如seq id no:16所示，引物prn12-jd-f的序列如seq id no:17所示，引物prn12-jd-r的序列如seq id no:18所示。
7、以上特别设计的2对引物用于构建prn12-irfp质粒，其构建的prn12-irfp质粒用于基于irfp基因的金黄色葡萄球菌菌株的构建。
8、一种基于irfp基因的金黄色葡萄球菌菌株的构建方法，使用所述的引物，主要包括以下依序进行的步骤：
9、(一)同源臂扩增构建
10、1)pcr扩增
11、提取金黄色葡萄球菌usa300的dna，以该金黄色葡萄球菌usa300的dna为模板，用引物sqr-up-f和sqr-down-r进行扩增，获得usa300扩增产物(1％琼脂糖凝胶电泳检测结果见图6，其中，marker为dl2000dna，lane1为usa300扩增产物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种构建基于iRFP基因的金黄色葡萄球菌菌株的引物，其特征在于：包括以下7对引物：Sqr-up-F、Sqr-down-R，Sqr-iRFP-F、Sqr-iRFP-R，iRFP-sqr-F、iRFP-sqr-R，sqr-pKOR1-F、sqr-pKOR1-R，pkor1-sqr-F、pKOR1-sqr-R，sqr-JD-F、sqr-JD-R，iRFP-F、iRFP-R；
2.根据权利要求1所述的构建基于iRFP基因的金黄色葡萄球菌菌株的引物，其特征在于：还包括以下2对引物：iRFP-KpnI-F、iRFP-EcoRI-R，pRN12-JD-F、pRN12-JD-R；
3.一种基于iRFP基因的金黄色葡萄球菌菌株的构建方法，使用权利要求1或2所述的引物，其特征在于：主要包括以下依序进行的步骤：
4.根据权利要求3所述的基于iRFP基因的金黄色葡萄球菌菌株的构建方法，其特征在于：所述pRN12-iRFP质粒的构建方法主要包括以下依序进行的步骤：
5.根据权利要求3所述的基于iRFP基因的金黄色葡萄球菌菌株的构建方法，其特征在于：所述S
6.根据权利要求4所述的基于iRFP基因的金黄色葡萄球菌菌株的构建方法，其特征在于：所述iRPF扩增产物经过电泳回收纯化后再进行下一步步骤。
7.一种基于iRFP基因的金黄色葡萄球菌菌株的应用，其特征在于：将含有权利要求3-6所述基于iRFP基因的金黄色葡萄球菌菌株的菌液注射到实验动物腹腔或骨髓腔内，之后立即在成像系统上，用波长620-660nm的Cy5近红外光源照射实验动物腹部，观察近红外荧光情况；其中，所述菌液中基于iRFP基因的金黄色葡萄球菌菌株的浓度≥1×104cfu。
...【技术特征摘要】
1.一种构建基于irfp基因的金黄色葡萄球菌菌株的引物，其特征在于：包括以下7对引物：sqr-up-f、sqr-down-r，sqr-irfp-f、sqr-irfp-r，irfp-sqr-f、irfp-sqr-r，sqr-pkor1-f、sqr-pkor1-r，pkor1-sqr-f、pkor1-sqr-r，sqr-jd-f、sqr-jd-r，irfp-f、irfp-r；
2.根据权利要求1所述的构建基于irfp基因的金黄色葡萄球菌菌株的引物，其特征在于：还包括以下2对引物：irfp-kpni-f、irfp-ecori-r，prn12-jd-f、prn12-jd-r；
3.一种基于irfp基因的金黄色葡萄球菌菌株的构建方法，使用权利要求1或2所述的引物，其特征在于：主要包括以下依序进行的步骤：
4.根据权利要求3所述的基于irfp基因的金黄色葡萄球菌菌株的构建方法，其特征在于：所...
【专利技术属性】
技术研发人员：方心俞，胡雪妮，胡洪新，丁海琦，陈旸，黄昌瑜，杨滨，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：
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