表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母及其构建方法，所述重组毕赤酵母是将人工合成的UBC13蛋白基因导入毕赤酵母中获得表达UBC13蛋白的重组菌。所述UBC13蛋白基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明专利技术还公开了构建所述重组毕赤酵母的方法。本发明专利技术的重组毕赤酵母可用来生产UBC13蛋白。

【技术实现步骤摘要】
表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母及其构建方法
本专利技术属于基因工程
，涉及一种能够表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母，以及该重组毕赤酵母的构建方法。
技术介绍
UBC13 蛋白即泛素连接酶E2N(Ubiquitin_conjugating enzyme E2N, UBE2N)，其广泛存在于人体多种细胞中，如皮肤细胞、淋巴细胞等，并在这些细胞中发挥重要功能。UBC13蛋白的主要生物学功能包括以下方面:1、UBC13的异二聚体UBE2V1-UBE2N和UBE2V2-UBE2N可以催化合成非正规的赖氨酸-63的多聚泛素链，这种类型的多聚泛素化不会使蛋白酶体降解蛋白质；2、UBC13调节目的基因的转录活性，且在细胞周期和分化过程中起调节作用；3、UBC13在无错误的DNA修复途径中起调节作用，对DNA损伤后的细胞生存起一定的作用；4、UBC13对调节性T淋巴细胞的活性起重要作用，从而影响免疫活动；等等。毕赤酵母表达系统具有表达量高、蛋白表达后可修饰、易规模化生产、成产成本较低、外源蛋白基因遗传性稳定等特点，已有多种外源蛋白基因在毕赤酵母中表达。毕赤酵母基因表达系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点:1、具有调控机理严格的醇氧化酶AOXl基因启动子；2、表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或者多拷贝的形式稳定结合；3、酵母菌株能进行高密度发酵，且外援表达产量高。目前国内外尚未见到利用毕赤酵母表达UBC13蛋白的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种表达UBC13蛋白的毕赤酵母及其构建方法。本专利技术所提供的表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母，是由携带有UBC13蛋白的重组表达载体转化的毕赤酵母，其中，所述重组表达载体中包含有SEQ ID N0.1所示的UBC13蛋白的核苷酸序列。其中，所述UBC13蛋白的基因来源于人。毕赤酵母表达系统具有很高的生物安全性，获得包括美国FDA在内的广泛认可。它能够对外源蛋白进行翻译后加工，使之更接近于天然蛋白的构象和活性，是一种广泛应用的真核表达系统。本专利技术所述毕赤酵母具体为毕赤酵母X33。本专利技术所述的重组表达载体使用的载体为pwPICZalpha质粒载体。本专利技术的另一目的是提供一种构建所述重组毕赤酵母的方法，包括如下步骤: 1)人工合成UBC13蛋白基因； 2)在质粒载体的多克隆位点插入UBC13蛋白基因，构建重组表达载体； 3)将所述重组表达载体导入毕赤酵母中，获得表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母。其中，所述毕赤酵母为毕赤酵母X33,所述重组表达载体使用pwPICZalpha质粒载体。本专利技术构建的表达UBC13蛋白的毕赤酵母命名为毕赤酵母X33\pwPICZalpha\UBC13。本专利技术所述的重组毕赤酵母可用来生产UBC13蛋白。本专利技术首次在毕赤酵母表达系统中分泌表达了人UBC13蛋白，分泌表达无需破碎细胞切培养基中杂蛋白含量极低，纯化步骤简单，适宜工业化生产。毕赤酵母适用于工业规模的高密度发酵，培养基廉价，操作简单，产物具有很好的生物安全性，适用于生活用品、食品和医药等领域。【附图说明】图1为Xho I和BcoR I酶切鉴定人工合成的含UBC13蛋白基因的重组质粒。图2为Xho I和BcoR I酶切鉴定含UBC13蛋白基因的pwPICZalpha重组表达质粒。图3为重组酵母表达后培养基上清液及上清液第一步纯化(过镍柱)后的SDS-PAGE电泳检测结果。图4为上清液第二步纯化(过阴离子交换柱)后的SDS-PAGE电泳检测结果。图5为UBC13蛋白浓缩后保存前的SDS-PAGE电泳检测结果。具体实施方法 实施例1:携带有UBC13蛋白基因的重组表达载体的构建。1、根据毕赤酵 母对密码子的偏好性，人工设计UBC13蛋白基因，并在碳端添加酶切位点Xho I，氮端添加酶切位点EcoR I，交与相关公司合成。人工设计的UBC13蛋白基因序列如SEQ ID N0.1所示。2、将含有合成的目的基因质粒的大肠杆菌在含0.1%氨苄的LB液体培养基中培养。用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6943-01*)提取人工合成的含目的基因的质粒，提取质粒用Xho I和EcoR I进行双酶切鉴定，将酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测。电泳检测结果如图1所示，在DNA分子量标准的500bp处检测出合成的UBC13蛋白基因，且酶切产物的目的条带为506bp，符合人工设计的碱基数。用OMEGA公司的Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01)回收上述双酶切产物。回收产物与用相同酶进行酶切后的pwPICZalpha载体在T4 DNA连接酶的作用下连接，连接条件4°C，连接12h，构建重组表达载体pwPICZalpha-UBC13。将重组表达载体pwPICZalpha_UBC13用热激法转化入大肠杆菌感受态细胞内，37°C、100-120rpm条件下培养lh。导入重组表达载体的大肠杆菌用含有0.l%Zeocin的LB平板在37 °C条件下筛选。选择6个阳性菌落分别接种到2ml含有0.l%Zeocin的LB液体培养基中，在37°C、180rpm条件下培养12-24h。然后用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6943-01*)提取重组质粒，并用Xho I和EcoR I进行双酶切鉴定。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测结果如图2所示，在DNA分子量标准的500bp处检测出重组的UBC13蛋白基因，酶切产物的目的条带为506bp，符合人工设计的碱基数。进而获得含有重组表达载体pwPICZalpha-UBC13的阳性大肠杆菌。含0.1%氨苄的LB液体培养基由如下物质组成:1.0gMOOml蛋白胨，0.5g\100ml酵母浸出粉，0.5g\100ml NaCl,0.lg\100ml氨苄西林钠。含0.1% Zeocin的LB平板由如下物质组成:1.0g\100ml蛋白胨,0.5g\100ml酵母浸出粉，0.5g\100ml NaCl, 1.5g\100ml 琼脂，0.lml\100ml Zeocin0含0.1% Zeocin的LB液体培养基由如下物质组成:1.0g\100ml蛋白胨，0.5g\100ml 酵母浸出粉，0.5g\100ml NaCl,0.lml\100ml Zeocin0实施例2:表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母的构建。一、感受态毕赤酵母X33的制备。1、取1.0ml毕赤酵母X33菌液加到50ml YPD液体培养基中，30°C、250rpm条件下培养 12-24h。2、将上述毕赤酵母菌液在4°C、1500g条件下离心5min。3、弃掉培养基，加50ml (TC冰水重悬，然后在4°C、1500g条件下离心5min。4、弃掉上述冰水，加25ml冰水重悬，然后在4°C、1500g条件下离心5min。5、弃掉上述冰水，加2ml冰山梨醇重悬，然后在4°C、1500g条件下离心5min。6、弃掉上述山梨醇，加适量(0.5ml左右)冰山梨醇重悬，即制备完成感受态毕赤酵母X33。二、重组表达载体的线性化及重组毕赤酵母的建立。 将Iml含有重组表达载体pwPICZalpha-UBC13的大肠杆菌菌液加到50m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母，是由重组表达载体转化的毕赤酵母，所述重组表达载体中包含有SEQ?ID?NO.1所示的UBC13蛋白的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种表达UBC13蛋白的重组毕赤酵母，是由重组表达载体转化的毕赤酵母，所述重组表达载体中包含有SEQ ID N0.1所示的UBC13蛋白的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于:所述的毕赤酵母为毕赤酵母X33。3.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于:所述的重组表达载体使用的载体为pwPICZalpha质粒载体。4.一种构建权利要求1至3中任一所述重组毕赤酵母的方法，包括如下步骤: ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏全，王志瑞，姜俊兵，范瑞诚，范阔海，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：