本发明专利技术涉及杂交瘤细胞株AFG1G6、其产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体及黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条。杂交瘤细胞株AFG1G6，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC?NO.C201021。其分泌产生的抗黄曲霉毒素G1单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素G1的50％抑制浓度IC50为1.8ng/mL，与黄曲霉毒素G2交叉反应率为7.6％，与黄曲霉毒素B1和黄曲霉毒素B2的交叉反应率均小于2％。由其获得的黄曲霉毒素G1免疫层析试纸条，用于黄曲霉毒素G1含量的测定，操作简单，灵敏度高，对检测溶液中黄曲霉毒素G1含量的最低检测限可达1ng/mL。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及杂交瘤细胞株AFG1G6、其产生的抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体及黄曲霉毒素Gl免疫层析试纸条。
技术介绍
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素Gl (AFGl)的毒性极强，强于氰化钾和砒霜。历史上发生过很多AFGl污染食物链引发的人类中毒事件。另外，AFGl还能污染多种原料，包括水果、干果、蔬菜、调味品、油料作物、烟草及中草药等，由此可见=AFGl对食物链的污染极其广泛，几乎在食物链的每个环节都能发现存在。除此，在热带和亚热带地区农产品和食品中AFGl的检出率更高，污染更严重，花生、玉米和花生油等粮油食品污染最为严重，同时，AFGl超标而导致的农产品国际贸易纠纷事件也时常发生，1999年、2000年、2001年我国出口欧盟的花生到岸后，40%以上被欧盟检出黄曲霉毒素总量和AFGl分量超标，遭到退货或被迫转口贸易，致使我国农产品进出口贸易蒙受巨大损失，影响了我国农产品国际市场声誉。因此，加强花生等农产品及制品中AFGl的检测、特别是速测，及时了解和掌握农产品中AFGl的污染情况对保障我国食品消费安全具有重要意义。 现有的黄曲霉毒素检测方法主要包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是黄曲霉毒素检测最常用的检测方法，该方法不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可开展，但存在试剂消耗量大、操作繁琐、结果易受干扰、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大等不足，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法等，这些方法灵敏度高，检测结果准确，但所需的仪器设备昂贵，样品前处理过程繁琐，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，检测过程耗时，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近年来发展起来的用于黄曲霉毒素检测的免疫分析技术克服了前两者的一些缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、检测成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小等优点，适于现场批量检测等。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素Gl的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得高质量的抗黄曲霉毒素Gl抗体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株AFG1G6、其产生的抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体及黄曲霉毒素Gl免疫层析试纸条。本专利技术提供了杂交瘤细胞株AFG1G6，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCCN0.C201021。其具有序列表中SEQ ID N0.1所示的抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID N0.2所示的抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC N0.C201021的杂交瘤细胞株AFG1G6分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。该抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素Gl，对黄曲霉毒素Gl的50%抑制浓度IC5tl为1.8ng/mL。抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体在黄曲霉毒素Gl含量测定中的应用。本专利技术提供的杂交瘤细胞株AFG1G6是采用两步筛选法获得的，其具体筛选过程为:将黄曲霉毒素Gl在H2SO4作用下转化为其半缩醛形式AFG2a,然后与BSA氨基发生醛胺缩合反应，在NaBH4还原作用下C = N被还原为C-N，生成AFG2a-BSA复合物完全抗原，然后用其免疫BALB/c小鼠4-6次，最后一次加强免疫用2倍于前一次免疫剂量的AFG2a-BSA,免疫3天后进行细胞融合，然后采用ELISA方法分两步筛选融合细胞:第一步采用间接ELISA法筛选出仅能抗黄曲霉毒素Gl而不抗载体蛋白BSA的阳性克隆；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，采用AFGl作为竞争原，选择吸光值低、灵敏度较高的阳性克隆， 采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复克隆2-3次后,最终筛选获得杂交瘤细胞株AFG1G6。本专利技术提供的抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体的制备方法，步骤如下:将上述获得的杂交瘤细胞株AFG1G6注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体。按上述方案，所述的纯化方法为辛酸-硫酸铵法，具体操作为:用双层滤纸过滤小鼠腹水，过滤后的腹水于4°c，12000r/min离心15min以上，吸取上清，将上清与4倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为30 35 μL，室温混合30 60min，4°C静置2h以上，然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用双层滤纸过滤后，加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.lmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节该混合液的pH至7.4，4°C预冷，缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为0.277g/mL, 4°C静置2h以上，然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用纯水透析，将充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷冻，然后用冷冻真空干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体，将抗体置-20°C冰箱中备用; 醋酸盐缓冲液:0.29g醋酸钠加入0.14ImL醋酸，纯水定容至IOOmL ； 0.01mol/L磷酸盐缓冲液:0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g，加水定容至IOOmL ； 0.lmol/L的磷酸盐缓冲液:8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，磷酸二氢钾0.2g，加水定容到IOOmL所得。黄曲霉毒素Gl免疫层析试纸条，它包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫、金标垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述检测线包被有黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG2a-BSA,所述的黄曲霉毒素人工合成完全抗原AFG2a-BSA是将黄曲霉毒素Gl在H2SO4作用下转化为其半缩醛形式AFG2a,然后与BSA氨基发生醛胺缩合反应，再在NaBH4还原作用下C = N被还原为C-N得到的，所述质控线包被有兔抗鼠多克隆抗体；所述金标垫横向喷涂有纳米金标记的抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素Gl单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株AFG1G6分泌产生的。按上述方案，所述的吸水垫长16 18mm,宽2 4mm ;检测垫长25 30mm,宽2 4mm ;金标垫长6 9mm,宽2 4mm ;样品垫长12 18mm,宽2 4mm,相邻各垫的交叠长度为I 3mm。本文档来自技高网...
【技术保护点】
杂交瘤细胞株AFG1G6，其特征在于：它保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC?NO.C201021。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李培武，张兆威，张奇，丁小霞，张文，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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