本发明专利技术涉及转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物、探针及其在PCR检测中的应用，正向、反向引物序列分别为：phyA2-1F:5'-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3'，phyA2-2R:5'-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3'。探针序列为：phyA2-P:FAM-5'-CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3'-Eclipse。利用本发明专利技术设计的引物与探针序列，建立了转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性定性PCR检测方法、SYBR?Green?I实时荧光定量PCR检测方法和TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法，这三种检测方法灵敏，准确，简单，可靠，具有广阔的应用价值与市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物、探针及其在PCR检测中的应用，属于分子生物学领域。
技术介绍
玉米是我国重要的饲料加工原料，其所含总磷的50%以上是以植酸形式存在，动物几乎不能消化利用，同时，植酸是抗营养因子，严重影响动物对钙、镁、铁、锌等元素的吸收。植酸酶是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和磷酸(或盐)的一类酶的总称，能水解植酸最终释放出无机磷。在动物饲料中添加外源植酸酶可以改良磷酸盐的生物利用度，消除植酸的抗营养作用，不仅能减少磷在环境中的排泄，降低农业生态的负担，同时也能减少动物饲料中无机磷的添加，缓解我国磷资源匮乏的局面。利用植物生物反应器生产植酸酶的研究由来已久，比如来源于WT烟曲霉的植酸酶和经过改造的热稳定植酸酶已经在小麦和大麦中成功表达；来源于无花果曲霉的植酸酶也已在烟草，苜蓿和马铃薯叶片中成功表达。我国科学家通过分离来自黑曲霉的植酸酶基因phyA2并构建到玉米特异表达载体上，得到了 27个表达植酸酶并能稳定遗传的转基因玉米纯合系。其种子中植酸酶活性均在1000U / kg以上，最高达到120000U / kg，完全达到中国饲料工业标准(Ikg玉米添加IOOOu植酸酶)的要求，可以替代传统工业生产的植酸酶添加剂。以玉米为载体生产的植酸酶直接用于饲料加工，实现了以环保、节能的农业生产方式生产“绿色磷”的梦想，具有巨大的产业优势和应用前景。我国将转基因植物的研究分为五个阶段:实验研究阶段、中间试验阶段、环境释放阶段、生产性试验阶段、申请安全证书与商业化生产阶段。转植酸酶基因玉米是我国自主研发，具有自主知识产权的玉米品系，目前，该转基因玉米于2009年11月获得农业部正式颁发的转基因生物生产应用安全证书，成为我国首例获得安全证书的粮食作物，也是国际上首例研制成功的转植酸酶基因玉米，标志着转植酸酶基因玉米在我国即将进入大规模商业化生产阶段。根据《农业转基因生物标识管理办法》规定，转基因产品必须进行标识管理，因而需要加强转植酸酶基因玉米相关的检测技术。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物、探针及其在PCR检测中的应用。本专利技术采取的技术方案为:—种转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物，正向、反向引物序列分别为:phyA2-lF:5’ -CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’，如 SEQ ID N0.1 所示，phyA2-2R: 5’ -GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’，如 SEQ ID N0.2 所示。一种转植酸酶基因玉 米phyA2基因特异性探针，序列为:phyA2-P:FAM-5’ -CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3' -Eclipse,如 SEQ ID N0.3所示。转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物在定性检测玉米及其相关产品是否含有转植酸酶基因玉米成分中的应用，方法如下:(I)提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用phyA2_lF和phyA2_2R引物组合进行PCR扩增；(2)上述PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品为含有转植酸酶基因玉米或其相关产品；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含转植酸酶基因玉米成分。步骤(I)所述的PCR 扩增为:95°C 5min 预变性；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 35个循环；72°C延伸7min。所述的转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物在SYBR Green I实时荧光定量检测玉米及其相关产品是否含有转植酸酶基因玉米成分中的应用，方法如下:(I)建立植酸酶玉米phyA2基因和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线:①提取转植酸酶基因玉米标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入转植酸酶玉米phyA2基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制植酸酶玉米phyA2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线；(2)提取待检测样品 基因组DNA,得基因组DNA提取液，然后向基因组DNA提取液中加入转植酸酶基因玉米phyA2基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增；扩增后，测定基因组DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的植酸酶玉米phyA2基因的定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的定量PCR标准曲线，计算出相应的拷贝数，则转植酸酶玉米phyA2基因的拷贝数与玉米内标准基因zSSIIb基因的拷贝数之t匕，即为待检测样品中转植酸酶玉米的百分含量。步骤(I)和(2)中，zSSIIb引物序列(国家标准)如下:zSSIIb-lF:5’ -CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’，SEQ ID N0.4 所示，zSSIIb-2R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’ ；SEQ ID N0.5 所示，植酸酶玉米phyA2基因的特异性引物序列如下:phyA2-lF:5，-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3，，SEQ ID N0.1 所示，phyA2-2R:5，-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3，，SEQ ID N0.2 所示，植酸酶玉米phyA2基因特异性引物扩增序列如下:CACAGACACAGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACC,如 SEQ ID N0.6所示。所述步骤(I)和(2)中，扩增的参数均如下:扩增反应体积为20uL，2XPremixEx Taq(Rox)IOuL,浓度为 10umol/L 的 Forward primer0.4uL,浓度为 10umol/L 的Reverse primer0.4uL, ddH208.2uL, DNA 模板 IuL.扩增反应条件:95 °C IOmin 预变性；95°C 15s, 60°C 30s,在60°C收集荧光信号，共计40个循环。所述的转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物和探针在TaqMan探针实时荧光定量检测玉米及其相关产品是否含有转植酸酶基因玉米成分中的应用，方法如下: (I)建立转植酸酶玉米phyA2基因和zSSIIb基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线:①提取转植酸酶基因玉米标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入转植酸酶玉米phyA2基因的特异性引物和荧光标记探针，以及zSSIIb基因的国家标准引物和荧光标记探针，进行扩增；②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制植酸酶玉米phyA2基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的Taq本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物，其特征是，正向、反向引物序列分别为：phyA2?1F:5“?CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC?3“phyA2?2R:5“?GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC?3“。
【技术特征摘要】
1.一种转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物，其特征是，正向、反向引物序列分别为:phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’ 。2.一种转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性探针，其特征是，序列为: phyA2-P:FAM-5’-CGACACCATCTCCACCAGCACCGT-3’-Eclipse。3.权利要求1所述的转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物在定性检测玉米及其相关产品是否含有转植酸酶基因玉米成分中的应用。4.权利要求3所述的应用方法，其特征，步骤为: (1)提取待检测样品基因组DNA，并以此为模板，利用phyA2-lF和phyA2_2R引物组合进行PCR扩增； (2)上述PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；若存在扩增产物，则待检测样品为含有转植酸酶基因玉米或其相关产品；若不存在扩增产物，则待检测样品中不含转植酸酶基因玉米成分。5.权利要求1所述的转植酸酶基因玉米phyA2基因特异性引物在SYBRGreen I实时荧光定量检测玉米及其相关产品是否含有转植酸酶基因玉米成分中的应用。6.权利要求5所述的应用方法，其特征，步骤为: (1)建立植酸酶玉米phyA2基因的SYBRGreen I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I 探针实时荧光定量PCR标准曲线: ①提取转植酸酶基因玉米标准品基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入转植酸酶玉米phyA2基因的特异性引物，以及zSSIIb基因的国家标准引物，进行扩增； ②扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制植酸酶玉米phyA2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线和zSSIIb基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线； zSSIIb基因的国家标准引物序列如下: zSSIIb-lF:5’-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’ zSSIIb-2R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’ ； 植酸酶玉米phyA2基因的特异性引物序列如下: phyA2-lF:5’-CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC-3’ phyA2-2R:5’-GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC-3’ ； 植酸酶玉米phyA2基因特异性引物扩增序列如下:CACAGACACAGAAGTGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAG...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙红炜，张广远，杨淑珂，李凡，徐晓辉，高瑞，路兴波，
申请(专利权)人：山东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。