一种治疗血管瘤的蛋白质制造技术

本发明专利技术涉及一种用于治疗血管瘤的蛋白质，是以人工合成一段DNA序列(scl)，然后将这段DNA序列重组于Pichia?pastoris基因组，在Pichia?pastoris中表达Scl蛋白；再用离子交换方法和亲和层析方法纯化Scl蛋白，所得蛋白质具有序列表中2项的序列。本发明专利技术的Scl蛋白可有效地诱发血管瘤细胞凋亡，抑制血管瘤细胞增殖，能有效地治疗血管瘤模型，为生产特效的抑制血管瘤的药物的研究和开发创造了必要的条件，具有重要的理论和实践意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质，具体涉及一种用于治疗血管瘤的蛋白质。
技术介绍
血管瘤(hemangioma)是以内皮细胞增生为特征的肿瘤，发病率:新生儿1%-2%，I岁时12%，体重低于IOOOg的早产儿发病率为22.9%，大约80%的血管瘤是单发，20%是多发[I]。血管瘤于出生后第一年生长迅速，I岁后生长速度减缓。血管瘤可见于身体的任何部位，以外表的血管瘤为多见，大约10%血管瘤发生于体内重要部位。生长在外表的血管瘤破坏周围组织，有些血管瘤呈浸润性生长，从而造成儿童美容缺陷。另外也可导致功能障碍。在少许情况下，血管瘤又有恶性进程特点，可出现诸多的并发症如:溃烂、出血、感染等；生长在体内的血管瘤压迫周围组织，影响脏器功能，如眶内血管瘤影响视力，纵隔或肺部血管瘤影响压迫气道，肝脏 或腹腔多发血管瘤造成脏器受压。巨大血管瘤可引起高排出量性心衰以及Kasabach-Merritt综合征(巨大血管瘤伴血小板减少综合征，KMS)等危及生命合并症。KMS占婴儿血管瘤的0.3-1%。因为大约25%的血管瘤在达到最大体积时能自行衰退，对于那些小的、位于不可能产生功能损害的部位以及慢生长的血管瘤，可以期待其衰退；但对于那些可以引起KMS，或影响视觉、呼吸、吞咽、泌尿、胃肠道和供血等生理功能，或快速生长以至于可以产生组织破坏，畸形或毁容，溃疡和大面积的皮肤枯斑的那些影响人的机体健康和身心健康的血管瘤则必须及时治疗。至今尚没有有效的治疗血管瘤的化学药物。而手术、冷冻、激光、放射、硬化剂、物理、激素等方法治疗的病例，经过远期随访，证实有后余损害，美容效果不理想，其并发症可达50%，并有30%的复发率。当前，亟待于开发新的抑制眼睛血管增生的药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种治疗血管瘤的蛋白质。是通过DNA序列合成方法合成一段DNA序列，将这段DNA序列重组于毕赤酵母中表达，表达产物活性分析证明，所合成基因编码的蛋白具有抑制血管新生和治疗血管瘤的功能。其核苷酸序列和它的氨基酸序列如序列表中所述。本专利技术的目的是通过以下技术措施实现:1.DNA序列的合成设计如下DNA序列，并用套叠PCR方法进行其序列合成。将其序列命名为scl。ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCAT CATCATCATCATCATTAG2.DNA序列编码蛋白功能的证明(I) DNA序列重组于酵母中表达通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用，将以上合成的DNA片段插入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K的多克隆位点，将其表达载体命名为pPIC9K-scl (附图1)。用电转法将pPIC9K-scl转化毕赤酵母65115，获得工程菌65115( 1091(-8(31)。用BMGY-BMMY 发酵 GSl 15 (pPICP9K-scl)诱导表达 Scl 蛋白。(2)表达产物活性分析发酵液上清过离子交换柱和N1-Agarose His标签蛋白纯化柱进行纯化(附图2)，收获的含目标蛋白的液体经过抽滤除盐后，进行抑制抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成试验验证其具有抑制新生血管生成的活性，并且，其抑制血管生成的活性强于血管生成抑制因子Angiostatin0 用 DeadEndTM Fluorometric TUNEL System(Promega)试剂盒进行实验证明Scl显著地诱发血管瘤细胞凋亡(P < 0.01)(附图3)，用噻唑蓝法细胞毒性试验证明Scl抑制血管瘤细胞增殖(P < 0.01))(附图4)。将人体的血管瘤细胞接种于裸鼠建立人体血管瘤模型，然后用Scl蛋白进行治疗证明Scl蛋白能有效地治疗血管瘤，是一种治疗人体血管瘤的药物。本专利技术是人工合成scl基因序列，将scl基因重组于毕赤酵母基因组进行表达获得Scl蛋白，Scl蛋白可有效地诱发血管内皮细胞凋亡率，抑制人体血管内皮细胞增殖，有效地抑制和治疗血管瘤，为生产 特效的抑制人体血管瘤的药物的开发创造了必要的条件，具有重要的理论和实践意义。附图说明附图1.构建含scl基因的毕赤酵母表达载体附图2.SDS-PAGE分析表达和纯化重组Scl蛋白M.蛋白Marker ；0.毕赤酵母发酵液；1.含scl基因的毕赤酵母的发酵液；2.离子交换纯化的洗脱I ;3.离子交换纯化的洗脱2 ;3.离子交换纯化的洗脱3 ;4.亲和纯化收获的重组Scl蛋白。附图3.Scl蛋白诱发血管瘤细胞凋亡a.PBS ；b.Scl附图4.Scl蛋白抑制血管瘤细胞增殖具体实施例方式1.DNA序列的合成(I)设计如下DNA序列。ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCATCATCATCATCATCATTAG(2)合成如下引物:P 1.5， ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCAC3，ρ2.5’ TTCTTGCCCTTGTAGTTGAAGATGACATGAACCTTCTTGGTGCCAGGGCCACAGATGTC3’ρ3.5， TTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGA3，ρ4.5，TGGTTGTCTGGCCGCACAATCAGTGTAAGGTGTGTAAACTCATCATCCTTGCAACGGAT3，ρ5.CTAATGATGATGATGATGATGGTTGTCTGGCCGCACAA3’(3)用如下套叠PCR法进行以上序列的合成，其步骤是:①应用Pl和ρ2引物进行PCR，获得产物I。②用Ρ3和ρ4引物进行PCR扩增，获得产物2。③以上获得的产物I和产物2的混合物为底物，用引物Pl和ρ5进行扩增，获得产物3。(4)将以上PCR产物3 连接于T载体，进行DNA序列分析证明所获的DNA序列与设计的一致:ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACATCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCATCATCATCATCATCATTAG2.序列编码蛋白功能的证明(I)DNA序列重组于酵母中表达及其表达产物的纯化通过DNA内切酶和T4 DNA连接酶的作用，将以上合成的DNA片段插入毕赤酵母表达载体PPIC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种治疗血管瘤的蛋白质，其特征在于编码这种蛋白质的核苷酸序列是：atgcacggag?actcagaata?caacatcatg?tttggtcccg?acatctgtgg?ccctggcacc?60aagaaggttc?atgtcatctt?caactacaag?ggcaagaacg?tgctgatcaa?caaggacatc?120cgttgcaagg?atgatgagtt?tacacacctt?acactgattg?tgcggccaga?caaccatcat?180catcatcatc?attag??????????????????????????????????????????????????195。

【技术特征摘要】
1.一种治疗血管瘤的蛋白质，其特征在于编码这种蛋白质的核苷酸序列是: atgcacggag actcagaata caacatcatg tttggtcccg acatctgtgg ccctggcacc 60 aagaaggttc atgtcatctt caactacaag ggcaagaacg tgctgatcaa caaggacatc 120 cgttgcaagg atgatgagtt tacacacctt acactgattg tgcggccaga caaccatcat 180 catcatcatc attag195。2.一种治疗血管瘤的蛋白质，其特征在于这种蛋白质的氨基酸序列是: Met His Gly Asp Ser Glu Tyr Asn He Met Phe ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱联，张泽华，沈锦城，张添元，罗进贤，尹慧祥，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南金宝正诚矿业有限公司，
类型：发明
国别省市：