本发明专利技术公开了两个位于猪7号染色体上的增加猪肋骨数的主效标记及其在种猪遗传改良中的应用。本发明专利技术采用实时定量TaqManPCR技术和PCR扩增后直接电泳的技术分别对g.103457401A>C和g.103458678_103458679ins291主效突变位点进行基因型判定，利用标记辅助选择（MAS）选择有利基因型对个体留种，可以提高商业猪种和中国地方猪种每个个体平均约1根的肋骨数量，从而增加猪的体长暨产肉量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物遗传育种领域，尤其是涉及两个增加猪肋骨数的主效标记及其在种猪遗传改良中的应用。
技术介绍
猪属于脊椎动物，猪的脊椎分为颈椎、胸椎、腰椎、荐椎和尾椎，猪的颈椎、荐椎和尾椎数相对固定，而胸椎和腰椎数存在差异，胸椎又俗称肋骨。猪肋骨数是重要的经济性状，且其遗传力高达0.6以上。肋骨数与猪的胴体长显著相关，随着肋骨数的增加，猪的胴体长也在相应的增长，每增加一根肋骨数可使体长增加80 _左右，猪的产肉量也因此得到了相应的增加。申请人:前期利用构建的大规模白色杜洛克猪X 二花脸猪F2资源群体，测定了1029头F2屠宰个体的脊椎数表型，通过全基因组扫描检测到了 7号染色体上影响猪肋骨数的主效基因位点(QTL)，初步定位的区间大小为900 kb。鉴于以上背景情况，申请人通过白色杜洛克猪X 二花脸猪F2资源群体、二花脸猪X通城猪F2资源群体和苏太猪群体的全基因组关联(GWAS)分析和后裔同源相同(IBD)分析，将QTL区间缩小到100 kb。对该区域开展重测序、多态位点的搜寻、鉴别及其与猪肋骨数相关性的研究，以期建立高效准确的基因育种技术开展猪肋骨数的选育工作。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供两个增加猪肋骨数的主效标记，即:序列表SEQ IDNO:1所示的位于猪7号染色体上的基因变异序列，序列标注位置为2401的A2401-C2401的核苷酸突变；序列表SEQ ID NO:1中序列标注位置为3678和3679之间的一个291个核苷酸的插入突变。通过现代分子生物学技术检测这两个主效标记，判定携带增加肋骨数有利等位基因的个体。本专利技术的第二个目的是增加猪肋骨数的主效标记在种猪遗传改良中的应用，即利用所鉴别的主效标记信息开展种猪选育，选择导致猪肋骨数更多的基因型个体留种，以提高种猪的肋骨数、胴体长和产肉量。本专利技术的第一个目的是这样实现的: 1、实验动物和表型测定 本专利技术所使用的猪群体共有4个:白色杜洛克猪X 二花脸猪F2资源群体、二花脸猪X通城猪F2资源群体、苏太猪(50%杜洛克猪和50%太湖猪血缘)群体和三元杂(杜洛克猪X长白猪X大白猪)群体。白色杜洛克猪X 二花脸猪F2资源群体以2头白色杜洛克公猪和17头二花脸母猪为祖代繁殖F1代，选9头F1公猪与59头F1母猪分6批次互交产生1912头F2个体，其中918头F2个体在240±3日龄屠宰以记录肋骨数表型数据。 二花脸猪X通城猪F2资源群体以I头二花脸公猪和I头通城母猪交配得到2头F1公猪和7头F1母猪，F1后代互交后产生61头F2个体，所有F2个体在60日龄屠宰以记录肋骨数表型数据。苏太猪是一个中国培育品种，它是由中国太湖猪和西方杜洛克猪种通过超过18个世代的培育而获得的猪种(各含50%太湖猪和50%杜洛克猪的血缘)；本专利技术中，4头苏太公猪与55头苏太母猪交配获得461头后代，其中的435头在240±3日龄屠宰以记录肋骨数表型数据。此外，1403头195±3日龄的三元杂商品猪的样本和肋骨数表型数据分9个批次从位于南昌蒋巷的江西国鸿有限公司屠宰场获得。、猪全基因组60KSNP判型 从上述4个实验群体中的每个个体采集一小块耳样、用标准苯酚-氯仿法提取全基因组DNA，经Nanodrop-1OO分光光度计检测质量后统一将浓度稀释至50 ng/μ ，送北京怡美通德有限公司在Illumina Beadstration平台上根据公司标准流程进行猪全基因组60KSNP芯片(Illumina,美国)基因型判定。利用R语言GenABEL包中checkmarker对所有样本60K芯片扫描分型数据进行质量控制，对于SNP检出率低于95%、家系孟德尔错误率高于0.1、最小等位基因频率小于0.1和哈代-温伯格平衡显著性水平高于10_6的个体信息将被剔除。、全基因组关联(GWAS)分析 为了消除群体层化效应，本专利技术采用线性混合模型单点回归分析并结合R程序中的GenABEL软件包进行GWAS分析。对于meta-analysis (整合分析),每个位点在3个群体中的X 2值整合在一起计算新的X 2值。基因组水平的显著区域采用保守的Bonferrini校正方法确定，即基因组显著水平阈值为0.05。GWAS分析结果如附图说明图1所示，从图1中可知，3个不同群体GWAS及meta-analysis的分析结果均将影响猪肋骨数的位点定位在7号染色体上。通过LOD (似然函数比值的对数)值下降2的方法，根据3个实验群体共享的置信区间，将GWAS定位的影响肋骨数的主效位点确定在7号染色体上一个947 kb的范围内，该区域对应于国际猪基因组参考序列(10.2版本)7号染色体的103.37 Mb至104.31Mb的区间。、后裔同源(IBD)定位分析 采用标记辅助分离分析方法判定白色杜洛克猪X 二花脸猪F2资源群体、二花脸猪X通城猪F2资源群体、苏太猪的Ftl和F1公猪QTL基因型。每头具有后裔表型测定猪只的QTL基因型由Z值决定，Z值为似然率比值Lm/Lm的Log值，Htl假定双等位基因QTL基因型为纯合子QQ或qq，Hi为杂合子Qq。当Z〈_2时，QTL基因型为QQ或qq ;当Z>2时，QTL基因型为Qq ;当-2〈Z〈2时，QTL基因型不能确定。通过simwalk2程序构建成功推导出QTL基因型个体的单倍型，并通过搜寻Q染色体共享的单倍型以缩小QTL区域。为将IBD区域缩小到尽可能小的区间内，本专利技术中首先使用60K高密度SNP芯片扫描数据进行IBD分析，具体结果见图2A。从该图可知，IBD区间被确定在SNP INRA0027623和ASGA0035500之间。为了将IBD区间进一步缩小，在SNP INRA0027623和ASGA0035500之间的猪基因组序列通过Ensembl网站(http://asia.ensembl.0rg/index, html)下载后，每隔约 20000 bp 用公用的 Primer3.0或Primer 5.0软件设计一对引物(共12对引物，见表I)对35个已知QTL基因型的个体进行PCR扩增。25 UL的聚合酶链式反应(PCR)反应体系中，包括40 ng猪基因组DNA，1.0 mM MgCl2,0.2 mM dNTP，正反向引物各 10 pmoI，2.5 单位 DNA聚合酶(Taq 酶)及 I XPCRbuffer (缓冲液)(上海博采公司)。 PCR采用Touchdown程序,扩增条件为:95°C 5 min ；94°C 30 s，68°C (每个循环降 0.5°C) 30 s，72°C 45 s，26 个循环；94°C 30 s，55°C 30 s,72°C 45 s，14个循环；最后在72 °C延伸10 min。PCR扩增产物采用QIAquick DNA纯化试剂盒(QIAGEN，Hilden，德国)纯化后委托上海生工生物工程有限公司直接测序，测序结果利用公用的DNAStar的SeqMan软件进行分析。对新获得的SNP信息再次进行IBD分析，Q染色体共享的区域如图2B所示，从图2B中可知，QTL区间被准确定位于一个100 kb (位于SNP 103451019 T>G 和 SNP 103552163 G>A 之间)的区间内。本文档来自技高网...
【技术保护点】
两个增加猪肋骨数的主效标记，其特征在于：序列表SEQ?ID?NO:1所示的位于猪7号染色体上的基因变异序列，序列标注位置为2401的A2401?C2401的核苷酸突变，对应于国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第103457401个核苷酸位点A>C突变；序列标注位置为3678和3679之间的一个291个核苷酸的插入突变，对应于国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第103458678和103458679核苷酸之间的一个291个核苷酸的插入突变。
【技术特征摘要】
1.两个增加猪肋骨数的主效标记，其特征在于:序列表SEQID NO:1所示的位于猪7号染色体上的基因变异序列，序列标注位置为2401的A2401-C2401的核苷酸突变，对应于国际猪基因组10.2版本参考序列7号染色体上第103457401个核苷酸位点A>...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄路生，任军，幸宇云，张志燕，艾华水，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：
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