一种C-反应蛋白及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种C－反应蛋白及其制备和应用。C－反应蛋白为序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。制备方法：以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物连接表达载体后得质粒pCsCRP，将其转化BL21(DE3)，获得转化子BL21/pCsCRP，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后，利用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为C－反应蛋白。本发明专利技术的C－反应蛋白能够与革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌结合并且对外周血白细胞具有显著的激活能力。所得蛋白在抗细菌感染中具有应用潜能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说是一种C 一反应蛋白及其制备和应用。
技术介绍
C 一反应蛋白(C-reactive protein)是穿透素(pentraxin)家族的一个成员。 C 一反应蛋白是由肝脏产生，在人类中它是一个经典的急性期反应蛋白，在炎症反应等急性条件下其浓度在血清中可升高上千倍，因此在临床上被用作疾病的指示。在免疫学上，C 一反应蛋白是一种模式识别受体，为天然免疫系统的重要组成成分。C 一反应蛋白能在钙离子存在的条件下特异性结合磷酸胆碱基团，从而与各种细菌结合。C 一反应蛋白与细菌的结合可诱发系列免疫调控反应，包括激活补体、促进细胞的吞噬等，因此C 一反应蛋白在疾病的免疫防控中具有应用价值。目前，C 一反应蛋白已在多种鱼类中发现，但是其功能和应用性研究尚缺乏。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种C 一反应蛋白及其制备和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种C 一反应蛋白为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示。C 一反应蛋白的制备方法，I)质粒pCsCRP的构建·以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒T-Simple5进行连接，连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养2 - 8h,筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSCRP ；将pTSCRP用Sma I酶切，回收0. 6kb片段，连接于pET259，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pCsCRP ；2) C —反应蛋白的制备将上述步骤I)的质粒pCsCRP转化BL21 (DE3)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pCsCRP ;将BL21/pCsCRP用终浓度为O. 5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达后，采用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列所示的C 一反应蛋白。所述步骤I)中 Fl 为 5’ -CCCGGGGCCACCATGCTACAAGATATGTCAGGAAAGA -3’ ;R1 为 5 ，-CCCGGGGTAGCACTGTGTTACTCTATC-3’。C 一反应蛋白的应用，所述C 一反应蛋白与细菌结合作为制备激活外周血白细胞的药物中的应用。所述C 一反应蛋白与革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌结合。所述革兰氏阴性细菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、大肠杆菌 (Escherichia coli)或鳗弧菌(Vibrio anguil larum);革兰氏阳性细菌为海豚链球菌 (Streptococcus iniae)。本专利技术具有如下优点本专利技术的C 一反应蛋白能够与革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌结合并且对外周血白细胞具有显著的激活能力。所得蛋白在抗细菌感染中具有应用潜能。附图说明图1为本专利技术实施例提供的纯化得到的C 一反应蛋白电泳图谱(其中，纯化得到的 C 一反应蛋白为泳道2 ;泳道1:分子量marker)。图2为本专利技术实施例提供的C 一反应蛋白激活外周血白细胞能力检测结果图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技 (北京)有限公司”的相应试剂盒。2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；酵母转化按 Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20);聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS — PAGE)按照 Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannua1. Cold Spring Harbor Laboratory Pres s2001o3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。实施例1本专利技术的C 一反应蛋白为序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列。序列表SEQ ID No.1 为: MEYKMAFLLMLVMLTSWVAALQDMSGKMFTFPIAPNRAYVKLITGTQEFKAVTICHRSFTDLRRDHALF SMATPSHYNSFLLFWDNTNKELEPHVMDKKAECAGLDYKMNMWHSICTTffDSTSGIVQIffFNGffPSIRKYSVTGQIQ SSSFVIILGQEQDSHGGGFDQSQSFVGMMTDVHMWNYVLSGCEIRNYSDERNFTPGNVISWKALEFEIVDKVLVEDR VTQCY(a)序列特征 长度228 类型氨基酸序列籲链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(C)假设否(d)反义否( e )最初来源半滑舌鳎结构特点该蛋白含有一个信号肽(由氨基酸I 一 20组成)和一个穿透素功能域 (由氨基酸21 — 226组成)。实施例2C 一反应蛋白的制备方法I)质粒pCsCRP的构建以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为 94。C60s预变性模板DNA，然后94。C40s，55。C60s，72。C60s，5个循环后改为 94。C40s，66° C60s, 72° C60s, 30 个循环后再在 72。C 延伸反应 7 — lOmin。PCR产物用天根的PCR产物纯化试剂盒纯化后与质粒T-Simple (购于北京全式金生物技术有限公司) 于室温连接2 - 8小时，连接混合液转化大肠杆菌DH5 α后在含安卡青霉素(100ug/ml)、 Xgal (40ug/ml)、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSCRP。将pTSCRP用Sma I酶切，回收O. 6kb片段。将表达载体pET259(pET259构建过程 #JALZheng, ff. J. , Hu, Y. H. , Sun, L., 2010. Cloning and ana lysis of a ferritin subunit from turbot (Scoph tha Imus maximus). Fish. Shellfish. Tmmunol · 28, 829 - 836)用 Swa I酶切后回收5. 4kb片段，将其与回收的0. 6kb片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a，在含卡那霉素(30ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pCsCRP。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5%蒸馏水。所述 Fl 为 5’ -CCCGGGGCCACCATGCTACAAGATATGTCAGGAAAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种C－反应蛋白，其特征在于：C－反应蛋白为序列表SEQ?IDNo.1中的氨基酸序列所示。

【技术特征摘要】
1.一种C 一反应蛋白，其特征在于C 一反应蛋白为序列表SEQ IDNo.1中的氨基酸序列所示。2.—种权利要求1所述C 一反应蛋白的制备方法，其特征在于 1)质粒PCsCRP的构建 以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与质粒T-Simple进行连接,连接混合液转化大肠杆菌后在含安卡青霉素、Xgal、异丙基-β -D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养2 - 8h,筛选转化子提取质粒，得重组质粒pTSCRP ； 将pTSCRP用SmaI酶切，回收O. 6kb片段，连接于pET259，连接液转化入大肠杆菌，在含卡那霉素的LB培养基上培养18 - 24小时，筛选转化子提取质粒，即为pCsCRP ； 2)C —反应蛋白的制备 将上述步骤I)的质粒pCsCRP转化BL21 (DE3)，在含有卡那霉素的LB培养基上培养，筛选转化子即为BL21/pCsCRP ;将BL21/pCsCRP用终浓度为O. 5mM的异丙基-β -D-硫代半乳...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，李墨非，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：