抗癌融合蛋白制造技术

融合蛋白，尤其是重组的融合蛋白，其包含结构域（a）和结构域（b），结构域（a）是可溶性hTRAIL蛋白序列的功能片段，始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或与其具有至少70%序列同源性的序列；结构域（b）是促细胞凋亡效应子肽的序列，结构域（b）的序列连接于结构域（a）的C末端和/或N末端。所述融合蛋白具有抗癌活性。编码所述融合蛋白的核苷酸序列，用于制备所述融合蛋白的表达载体和宿主细胞，以及所述融合蛋白用于治疗癌症疾病的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及治疗性融合蛋白、特别是重组融合蛋白的领域。更具体地，本专利技术涉及包含可溶性人TRAIL蛋白的序列片段和短的促细胞调亡肽的序列的融合蛋白，包含它们的药物组合物，它们在治疗、特别是抗癌试剂中的用途，以及编码所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含这些表达载体的宿主细胞。细胞调亡（程序性细胞死亡）是在预防癌症和治疗癌症（使用诱导异常癌细胞的细胞调亡的试剂）中具有重要作用的过程。细胞调亡的信号传导可以起源于细胞外部（外部或死亡受体途径）或起源于细胞内部（内部或线粒体途径）。人类癌细胞中的外部细胞调亡途径的激活需要配体与细胞死亡受体结合以激活受体。在配体结合之后，激活的受体诱导细胞调亡信号。通过线粒体途径的细胞内的内部细胞调亡的起始可以起始于不同水平的细胞调亡级联以最终引起促细胞调亡蛋白(细胞色素c、SmacDiablo、AIF、p53、Bcl2蛋白家族，包括BH3结构域家族)的功能的诱导或恢复，核酸降解或胱天蛋白酶的激活。TRAIL蛋白属于细胞因子家族（肿瘤坏死因子相关的细胞调亡诱导性配体），也被称作Apo2L(Apo2-配体)，是肿瘤细胞和被病毒感染的细胞中的细胞调亡的强有力的激活子。TRAIL是体内天然产生的配体。TRAIL蛋白，其氨基酸序列，编码DNA序列和蛋白表达系统首次公开于EP0835305A1。TRAIL蛋白通过与促细胞调亡TRAIL表面受体1和2（TRAIL-R1/R2）结合并随后激活这些受体来发挥其抗癌活性。这些受体，也被称作DR4和DR5（死亡受体4和死亡受体5），属于TNF受体家族并且在不同类型的癌症细胞上过表达。所述受体的激活可诱导独立于抑制基因p53的外部细胞调亡信号传导途径，其通过激活的胱天蛋白酶-8引起执行性胱天蛋白酶的激活，从而降解核酸。在TRAIL激活后释放的胱天蛋白酶-8也可引起Bid蛋白的释放，从而间接激活线粒体途径，Bid蛋白转位至线粒体，在那里其刺激细胞色素c的释放，因此间接扩大来自死亡受体的细胞调亡信号。TRAIL选择性作用于肿瘤细胞，基本上不诱导健康细胞的调亡，健康细胞对该蛋白是抗性的。因此，认识到TRAIL作为抗癌试剂的巨大潜力，其作用于多种不同类型的肿瘤细胞，包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤，同时不影响正常细胞并显示出潜在相对小的副作用。TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281个氨基酸的长度，在被蛋白酶切割后，其包含氨基酸残基114-281的细胞外区域形成大小为20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是生物活性的。TRAIL和sTRAIL这两种形式都能通过与存在于靶细胞上的TRAIL受体相互作用而激发细胞调亡。使用细胞系测试证明了TRAIL分子的可溶性部分的强烈的抗肿瘤活性和非常低的系统性毒性。同样，对于具有对应于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重组人可溶性TRAIL（rhTRAIL）（在INN下称作dulanermin）的人类临床研究显示出其良好的耐受性并且没有剂量限制性毒性。近期的研究显示TRAIL蛋白可具有比氨基酸114-281更短的形式，以这种形式也能结合DR家族的膜受体（死亡受体DR1、DR2、DcR1、DcR2和OPG)并通过这些受体诱导细胞调亡(F.,FANG,A.,WANG,S.,F.,YANG,Antitumor activity of a novel recombinant mutanthuman tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,ActaPharmacologica Sinica2005Nov;26(11):1373–1381)。最近报道的重组TRAIL蛋白对于肝细胞的毒性效应似乎与修饰即多聚组氨酸标签相关，非标签化的TRAIL不显示系统性毒性。然而，在进一步研究和开发的过程中，很多癌症细胞似乎也显示出对于TRAIL的原发性或获得性抗性（见例如WO2007/022214）。虽然对于TRAIL的抗性的机理尚未完全了解，但是相信其可在不同水平的TRAIL诱导的细胞调亡途径表现其自己，从细胞表面上的受体水平到信号传导途径内的执行性胱天蛋白酶。这种抗性限制了TRAIL作为抗癌试剂的有用性。此外，在对患者进行的临床试验中证明，TRAIL作为单一治疗的实际有效性是低下的。为了克服这种低的效率和肿瘤对TRAIL的抗性，设计了与放疗和化疗试剂的多种组合治疗，其产生了协同性细胞调亡效应(WO2009/002947;A.Almasan and A.Ashkenazi,CytokineGrowth Factor Reviews14(2003)337-348;RK Srivastava,Neoplasis,Vol3,No6,2001,535-546,Soria JC et al.,J.Clin.Oncology,Vol28,No9(2010),p.1527-1533)。在WO2009/140469中描述了rhTRAIL与所选择的常规的化疗试剂(紫杉醇、卡铂)和单克隆抗-VEGF抗体组合用于癌症治疗的用途。然而，此类组合必然意味着公知的常规化疗或放疗的缺陷。包含通过金属蛋白酶切割位点连接子连接的血管生成抑制剂血管抑制素(vasostatin)和TRAIL的序列的构建的融合蛋白被描述为在肿瘤细胞中显示出诱导细胞调亡的效应，见A.I.Guo et al,ChineseJournal of Biochemistry and Molecular Biology2008,vol.24(10),925-930。包含血管生成抑制剂肿瘤抑素(tumstatin)的Tumstatin183-230和TRAIL114-281的序列的构建的融合蛋白被描述为显示出诱导胰腺癌细胞的细胞调亡，见N.Ren et al,Academic Journal of Second MilitaryMedical University2008,vol.28(5),676-478。US2005/244370和对应的WO2004/035794公开了TRAIL95-281的构建体，其作为效应子结构域，通过肽连接子与作为细胞表面结合结构域的TNF家族配体的另一成员CD40的细胞外部分连接。其指出该构建体的激活是通过其CD40部分的结合。此外，与TRAIL治疗相关的问题已被证明是其低稳定性和在施用后从体内迅速被本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.25 PL 3916271.融合蛋白，其包含：
结构域（a），其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该
片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸；或与其具有至少
70%同源性的序列；和
结构域（b），其为促细胞凋亡效应子肽的序列，其通过内部细
胞凋亡途径发挥其促细胞调亡作用，其中结构域（b）的序列连接于
结构域（a）的C末端和/或N末端。
2.权利要求1的融合蛋白，其中结构域（a）是可溶性hTRAIL
蛋白序列的片段，该片段始于hTRAIL95至hTRAIL121的氨基酸，
含端点，终于氨基酸hTRAIL281。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中结构域（a）选自：
hTRAIL114-281 (SEQ. No. 27), hTRAIL119-281 (SEQ. No. 28),
hTRAIL121-281 (SEQ. No. 29), hTRAIL116-281和hTRAIL120-281。
4.权利要求1的融合蛋白，其中结构域（a）是序列
hTRAIL95-281。
5.权利要求1-4任一项的融合蛋白，其中结构域（b）选自：
SEQ. NO. 30的Bax蛋白的BH3结构域的片段；
SEQ. NO. 31的Bid蛋白的片段；
SEQ. NO. 32的核糖核酸酶A；
SEQ. NO. 33的细胞色素C；
SEQ. NO. 34的粒酶B；
SEQ. NO. 35的Nur77蛋白的片段；
SEQ. NO. 36的Bak蛋白的BH3结构域；
SEQ. NO. 37的PUMA/BBC3蛋白的BH3结构域；
SEQ. NO. 38的PUMA/BBC3蛋白；
SEQ. NO. 39的SMAC/Diablo蛋白的片段；
SEQ. NO. 40的buforin A；
SEQ. NO. 41的豹蛙酶；
SEQ. NO. 42的Mdm2蛋白的片段；
SEQ. NO. 43的与Mdm2结合的肽；
SEQ. NO. 44的lunasin的片段；
SEQ. NO. 45的Bik蛋白的BH3结构域；
SEQ. NO. 46的蛋白酶体的肽抑制剂；
SEQ. NO. 47的包含蛋白酶体结合性UIM基序的结构域；
SEQ. NO. 151的azurin衍生的肽；
SEQ. NO. 152的全长azurine肽；
SEQ. NO. 153的从aPP蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计的肽；
SEQ. NO. 154的从aPP蛋白和Bax蛋白的BH3结构域设计的肽；
SEQ. NO. 155的Reticulon RTN1-C衍生的肽；
SEQ. NO. 156的全长人Reticulon 3；
SEQ. NO. 157的修饰的组成型活性胱天蛋白酶-3；
SEQ. NO. 158的来自Par-4蛋白的SAC结构域；
SEQ. NO. 159的Noxa蛋白；
SEQ. NO. 160的Noxa蛋白的MTD/CKP片段；
SEQ. NO. 161的短的杂合肽Antp-TPR；
SEQ. NO. 162的Stat3蛋白的SH2结构域的肽抑制剂；
SEQ. NO. 163的Bak蛋白的BH3结构域衍生的肽；
SEQ. NO. 164的Bad蛋白的BH3结构域衍生的肽；和
SEQ. NO. 165的来自Bfl1蛋白的肽ATAP。
6.权利要求1-5任一项的融合蛋白，其在结构域（a）和结构域
（b）之间包含结构域（c），所述结构域（c）包含被存在于肿瘤细胞

\t环境中的蛋白酶识别的蛋白酶切割位点，其选自金属蛋白酶MMP识
别的序列，尿激酶uPA识别的序列，弗林蛋白酶识别的序列，及其组
合。
7.权利要求6的融合蛋白，其中金属蛋白酶MMP识别的序列是
SEQ. No. 51, SEQ. No. 171或SEQ. No. 173，尿激酶uPA识别的序列
是SEQ. No. 52，弗林蛋白酶识别的序列是SEQ. No. 53或Seq. No.
172。
8.权利要求6或7的融合蛋白，其中结构域（c）是彼此相邻的
金属蛋白酶MMP识别的序列与尿激酶uPA识别的序列的组合。
9.权利要求6或7的融合蛋白，其中结构域（c）是弗林蛋白酶
识别的序列。
10.前述权利要求任一项的融合蛋白，其中结构域（b）另外与转
运结构域（d）相连，所述转运结构域（d）选自：
（d1）靶向内质网的序列；
（d2）穿过细胞膜转运的多聚精氨酸序列，其包含6、7、8或9
个Arg残基；
（d3）选自SEQ. NO. 54或SEQ. NO. 176的铜绿假单胞菌转位结
构域；
（d4）膜转运结构域；
（d5）细胞核定位结构域；和
（d6）线粒体靶向结构域；
及其组合。
11.权利要求10的融合蛋白，其中靶向内质网的序列(d1)是
KEDL (SEQ. No. 55)或KDEL (SEQ. No. 56)。
12.权利要求10或11的融合蛋白，其中靶向内质网的序列(d1)
位于融合蛋白的C末端。
13.权利要求10的融合蛋白，其中多聚精氨酸序列(d2)位于融合
蛋白的C末端。
14.权利要求10的融合蛋白，其中多聚精氨酸(d2)位于结构域（b）
和（c）之间。
15.权利要求10的融合蛋白，其中铜绿假单胞菌转位结构域(d3)
位于位于结构域（a）和（c）之间。
16.前述权利要求任一项的融合蛋白，其在结构域(a),...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·S·皮耶奇克兰，S·D·帕夫拉克，B·M·泽雷克，K·K·莱姆克，
申请(专利权)人：阿达梅德公司，
类型：
国别省市：