抗癌融合蛋白制造技术

融合蛋白，包含：结构域(a)，其为hTRAIL蛋白序列的功能片段，所述片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸并终止于氨基酸hTRAIL281，或具有至少70％序列同一性、优选85％的同一性的所述功能片段的同源物；和至少一个结构域(b)，其为在细胞膜中形成孔的溶细胞效应子肽的序列，其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端或N末端。所述融合蛋白可用于治疗癌症疾病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】抗癌融合蛋白本专利技术涉及治疗性融合蛋白、特别是重组融合蛋白的领域。更具体地，本专利技术涉及包含可溶性人TRAIL蛋白序列的片段和在细胞膜或线粒体膜中形成孔的肽的序列的融合蛋白，包含它们的药物组合物，它们在治疗、特别是抗癌试剂中的用途，以及编码所述融合蛋白的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的表达载体，以及包含这些表达载体的宿主细胞。TRAIL(肿瘤坏死因子相关的细胞调亡诱导性配体)蛋白，细胞因子家族的成员，也被称作Apo2L(Apo2-配体)，是肿瘤细胞和被病毒感染的细胞中的细胞调亡的强有力的激活子。TRAIL是体内天然产生的配体。TRAIL蛋白，其氨基酸序列，编码DNA序列和蛋白表达系统首次公开于EP0835305A1。TRAIL蛋白通过与促细胞调亡表面TRAIL受体1和2(TRAIL-R1/R2)结合并随后激活这些受体来发挥其抗癌活性。这些受体，也被称作DR4和DR5(死亡受体4和死亡受体5)，是TNF受体家族的成员并且在不同类型的癌症细胞上过表达。这些受体的激活能诱导阻抑基因p53非依赖性细胞调亡的外部信号传导途径，其通过激活的胱天蛋白酶-8引起执行性胱天蛋白酶的激活，从而降解核酸。在TRAIL激活后释放的胱天蛋白酶-8也可引起截短的Bid蛋白的释放，所述截短的Bid蛋白转位至线粒体，在那里其刺激细胞色素c的释放，因此间接扩大来自死亡受体的细胞调亡信号。TRAIL选择性作用于肿瘤细胞，基本上不诱导健康细胞的调亡，健康细胞显示对该蛋白的抗性。因此，认识到TRAIL作为抗癌试剂的巨大潜力，其作用于多种不同类型的癌症，包括血液恶性肿瘤和实体肿瘤，同时极少影响正常细胞并显示出潜在相对小的副作用。TRAIL蛋白是II型膜蛋白，其具有281个氨基酸的长度，在被蛋白酶切割后，它的包含氨基酸残基114-281的细胞外区域形成大小为20kDa的可溶性sTRAIL分子，其也是具有生物活性的。TRAIL和sTRAIL这两种形式都能通过与存在于靶细胞上的TRAIL受体相互作用而激发细胞调亡。使用细胞系测试证明了TRAIL分子的可溶性部分的强烈的抗肿瘤活性和非常低的系统性毒性。同样，对于具有对应于hTRAIL的氨基酸114-281的氨基酸序列的重组人可溶性TRAIL(rhTRAIL)(在INN下称作dulanermin)的初步人类临床研究显示出其良好的耐受性并且没有剂量限制性毒性。到目前为止所报道的重组TRAIL蛋白对于肝细胞的毒性效应似乎与修饰即多聚组氨酸标签的存在相关，而非标签化的TRAIL不显示系统性毒性。短于114-281的TRAIL片段也能结合膜死亡受体并通过这些受体诱导细胞调亡，如最近就122-281hTRAIL的重组循环序列改变的突变体所报道的，例如见EP1688498。然而，在对患者的进一步临床试验中，TRAIL作为单一疗法的实际功效被证明是低的。同样有问题的是，通过很多癌细胞显示出对于TRAIL的原发性或获得性抗性(见例如WO2007/022214)。抗性可因不同机制产生，并且对于癌症类型是特异性的和/或是患者依赖性的(ThorburnA,BehbakhtK,FordH.TRAILreceptor-targetedtherapeutics:resistancemechanismsandstrategiestoavoidthem.DrugResistUpdat2008；11:17-24)。该抗性限制TRAIL作为抗癌剂的有用性。虽然对于TRAIL的抗性的机理尚未完全了解，但是相信其可在TRAIL诱导的细胞调亡途径的不同水平表现其自己，从细胞表面受体水平到信号传导途径内的执行性胱天蛋白酶的水平。为了克服这种低的效率和肿瘤对TRAIL的抗性，设计了与放疗和化疗试剂的多种组合治疗，其产生了协同性细胞调亡效应(WO2009/002947；A.AlmasanandA.Ashkenazi,CytokineGrowthFactorReviews14(2003)337-348；RKSrivastava,Neoplasis,Vol3,No6,2001,535-546,SoriaJCetal.,J.Clin.Oncology,Vol28,No9(2010),p.1527-1533)。在WO2009/140469中描述了rhTRAIL与所选择的常规的化疗试剂(紫杉醇、卡铂)和单克隆抗-VEGF抗体组合用于癌症治疗的用途。然而，此类组合必然意味着公知的常规化疗或放疗的缺陷。然而，关于表明通过将TRAIL蛋白与其它蛋白质或其片段融合获得的细胞对TRAIL的抗性的消除的任何数据，现有技术没有提及。此外，与TRAIL治疗法相关的问题表现为其低稳定性以及在施用之后迅速从身体清除。作为细胞膜或线粒体膜的破裂(不连续性)的结果的癌细胞的破坏和肿瘤增殖的抑制的作用是已知的。还尝试使用具有能够破裂膜的溶细胞作用的物质作为抗癌疗法和辅助抗癌疗法。许多具有溶细胞活性的天然和合成肽及蛋白质是已知的。溶细胞肽也被描述为成孔肽或溶细胞素。成孔肽与膜表面的相互作用可基于带正电荷的肽与带负电荷的细胞膜表面的非特异性静电相互作用。这些肽通常具有阳离子特征，以便它们能够与具有主要带负电荷的颗粒的表面发生静电相互作用。当溶细胞肽与细胞表面上的脂质接触并相互作用时，以及在渗入细胞后与线粒体膜表面上的脂质相互作用时，发生细胞膜的连续性的中断，随后形成小尺寸的跨膜孔，发生细胞质的内容物包括离子至细胞外的渗漏，从而导致细胞内快速且不可逆的电解质失衡、细胞裂解和死亡。成孔肽与膜表面的相互作用还可包括与存在于表面上的特定受体的相互作用。细菌、植物或哺乳动物来源的能够在细胞膜中形成孔的已知的天然存在的溶细胞肽通常称为溶血素，因为它们引起红细胞和其它真核细胞的裂解。这些毒素包括天蚕抗菌肽A和B、aurein1.2、citropin1.1、防卫素(HNP-2)、牛乳铁蛋白(lactoferricinB)、速普肽、PR-39、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的溶细胞素、δ溶血素、白喉毒素、霍乱弧菌(Vibriocholerae)的溶细胞素、来自红海葵(Actiniaequina)的毒素、粒溶素、来自中链球菌(Streptococcusintermedius)的裂解肽、慢病毒裂解肽、伴放射菌放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)的白细胞毒素、爪蟾抗菌肽、蜂毒肽、淋巴毒素、脑啡肽、摩西鱼毒肽(paradaxin)、穿孔素(特别是其N末端片段)、来自产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的细胞溶素O(PFO/θ毒素)和链球菌溶血素。它们作为药剂的有用性受到它们引起溶血的能力限制。天然溶细胞肽描述于例如R.Smolarczyketal.,Hig.Med.2009；63:360-368中。还存在已知的合成溶细胞成孔肽。它们被设计来避免溶血性质，具有不太强的免疫原性，或具有使得能够具有对细胞靶例如VEGFR(血管内皮生长因子受体)家族受体和EGFR(表皮生长因子受体)家族的受体的高结合特异性的表面。它们是天然溶细胞肽片段的杂合体，例如天蚕抗菌肽A片段与爪蟾抗菌肽2的杂合体CA(1-8)MA(1-12)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其包含：‑结构域(a)，其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于不低于hTRAIL95的位置处的氨基酸并终止于位置hTRAIL281处的氨基酸，或具有至少70％序列同一性、优选85％的同一性的所述功能片段的同源物，和‑至少一个结构域(b)，其为在细胞膜中形成孔的溶细胞效应子肽的序列，其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端和/或N末端。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.28 PL P.3975951.一种融合蛋白，其包含：-结构域(a)，其为可溶性hTRAIL蛋白的序列的功能片段，该片段起始于hTRAIL95至hTRAIL121的位置处的氨基酸，含端点，并终止于位置hTRAIL281处的氨基酸，和-结构域(b)，其为在细胞膜中形成孔的溶细胞效应子肽的序列，其中结构域(b)的序列连接于结构域(a)的C末端或N末端，并且选自:-SEQ.No.37的pilosulin-5,-SEQ.No.41的14个氨基酸的合成裂解肽，和-SEQ.No.48的流感病毒血凝素的HA2结构域的片段。2.权利要求1的融合蛋白，其中结构域(a)选自hTRAIL95-281、hTRAIL114-281、hTRAIL115-281、hTRAIL116-281、hTRAIL119-281和hTRAIL121-281。3.权利要求1至2的任一项的融合蛋白，其在结构域(a)与结构域(b)之间或结构域(b)之间包含含有蛋白酶切割位点的结构域(c)，其选自被金属蛋白酶MMP识别的序列、被尿激酶uPA识别的序列和被furin识别的序列。4.权利要求3的融合蛋白，其中被金属蛋白酶MMP识别的序列是ProLeuGlyLeuAlaGly，被尿激酶uPA识别的序列是ArgValValArg，被furin识别的序列是ArgLysLysArg，被furin识别的序列是ArgHisArgGlnProArgGlyTrpGluGlnLeu或HisArgGlnProArgGlyTrpGluGln。5.权利要求3的融合蛋白，其中结构域(c)是彼此相邻的被金属蛋白酶MMP识别的序列与被尿激酶uPA识别的序列的组合。6.权利要求3的融合蛋白，其中结构域(b)的效应子肽额外地连接有转运结构域(d)，所述转运结构域选自:(d1)转运通过细胞膜的多聚组氨酸序列，其包含6、7、8、9、10或11个His残基，(d2)转运通过细胞膜的多聚精氨酸序列，其由6、7、8、9、10或11个Arg残基组成,(d3)PD4转运序列(蛋白质转导结构域4)TyrAlaArgAlaAlaAlaArgGlnAlaArgAla,(d4)由转铁蛋白受体结合序列组成的转运序列ThrHisArgProProMetTrpSerProValTrpPro，和(d5)PD5转运序列(蛋白质转导结构域5，TAT蛋白)TyrGlyArgLysLysArgArgGlnArgArgArg,及其组合。7.权利要求6的融合蛋白，其中序列(d)位于效应子肽结构域(b)的C末端或N末端。8.权利要求6的融合蛋白，其中转运结构域(d)位于结构域(b)与结构域(c)之间，或位于结构域(a)与结构域(c)之间，或位...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·S·皮耶奇克兰，S·D·帕夫拉克，B·M·泽雷克，P·K·鲁兹加，
申请(专利权)人：阿达梅德公司，
类型：发明
国别省市：波兰;PL