本发明专利技术涉及一种家蚕天然免疫蛋白Hemolin及其纯化方法，属于蛋白纯化技术领域。本发明专利技术以蚕蛹作为原料，通过不同的离心方法，超滤，得到含有免疫蛋白的组分，将含有目的蛋白的上清溶液然经过AKTAexplorer10蛋白纯化系统中简单的层析技术分离纯化得到目的蛋白Hemolin。本发明专利技术主要是利用了Superdex200和Superdex75凝胶层析，这为天然免疫蛋白的纯化提出了一种全新的解决方法，具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及,属于蛋白质
技术介绍
Hemolin作为昆虫所特有的一种防御蛋白，在研究昆虫的免疫机制中有重要的意义。目前对其结构和功能的研究都取得了一定的成果，但是对其在体外的功能研究较少，所以本实验通过简单的纯化得到较纯的Hemolin,进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础, 也可以在此基础上对它的结构做更深入的探索。因为基因工程产品的组分复杂、对产品的纯度要求较高且蛋白在纯化过程中存在聚集变性的趋势，所以它的制备和纯化比一般产品要困难的多。虽然人们普遍使用制备型 HPLC进行基因工程产物的最后一步纯化，但由于HPLC具有对软硬件的要求较高，前期投入大，纯化量有限，价格昂贵，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多等缺点。而Superdex 75蛋白纯化系统具有纯化量大、流速快，负载量较大，层析条件易控制，非特异性吸附小等优点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供， 该方法以家蚕杆状病毒感染的蚕蛹为原料，通过多种离心方法得到含有天然免疫蛋白的溶液；将母液进行活性测定后，将活性高的母液脱糖，脱糖溶液与母液按10:1比例通过宏吸的方法过300K膜包去除糖分；将去糖的母液与蛋白提取液按1:2. 5混合，在4°C冰箱中缓慢搅拌过夜；之后通过弱阴离子交换柱(DEAE)初步分离，再通过琼脂糖凝胶柱 (SuperdexTM 200、SuperdexTM 75 )进一步纯化。为达到上述目的，本专利技术提供一种家蚕天然免疫蛋白Hemolin，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. I 所示。上述家蚕天然免疫蛋白Hemolin的纯化方法,包括以下步骤(1)家蚕免疫蛋白母液的制备；(2)家蚕天然免疫蛋白的分离纯化。进一步地，其中步骤(I)中所述家蚕免疫蛋白母液的制备具体包括a.保存于_20°C的蚕蛹与4°C预冷的灭菌ddH20以1:3的重量百分比混合在冰上匀浆2min,将匀楽液置于冰上停留5 min,重复9次；b.于15000rpm,4°C离心60 min,重复5次,最后一次用4层纱布过滤；c.过滤后的上清液取200mL与水按I:I的体积混合,用O. 22 μ m膜包过滤,重复10次, 上清溶液恢复到200mL的体积；d.步骤c所得上清液于50000rpm,10°C离心40min后，出现的黑团用超滤液重悬进行区带离心；取样品300ml进行蔗糖密度梯度离心3h;e.将步骤d离心3h后所得的上清液用质量体积浓度为60%的蔗糖溶液下样，按35mL/ 管收集，并在每管中取3mL做比活测定。进一步地，其中步骤d中所述样品的蔗糖密度梯度离心为铺制pH 7. 4的磷酸盐缓冲液200ml，样品300ml，30%蔗糖400ml，55%蔗糖充满，22000rpm密度梯度离心3h。进一步地，其中步骤d中所述区带离心的条件为50000rpm, 10°C离心40min ;样品为步骤c所得上清液；蔗糖浓度为质量体积浓度。进一步地，其中步骤d中所述pH 7. 4的磷酸盐缓冲液的制备方法为将8g NaCl,O.2g KC1、3. 58g Na2HPO4 · 12Η20、0· 27g KH2PO4 溶于 800mL 无菌去离子水中，定容至 IOOOmL即得。进一步地，其中步骤(2)中所述家蚕天然免疫蛋白的分离纯化具体包括a.将活性高于26的母液与脱糖组分按1:10的体积比例通过宏吸的方法，过300K膜包去除糖分；b.将去糖的母液与蛋白提取液按1:2.5的体积比混合，在4°C冰箱中缓慢搅拌过夜；c.之后通过弱阴离子交换柱DEAE初步分离，将分离所得的溶液用IOOkD的超滤管进行浓缩；d.琼脂糖凝胶柱分离，得到8个峰，并将每个不同的峰分批浓缩；e.浓缩含目的蛋白的峰，用琼脂糖凝胶柱进一步纯化得到目的蛋白，并用SDS-PAGE鉴定。进一步地,其中步骤(d)中所述琼脂糖凝胶柱为SuperdexTM 200凝胶柱。进一步地,其中步骤(e)中所述琼脂糖凝胶柱为SuperdexTM 75凝胶柱。本专利技术以蚕蛹作为原料，通过不同的离心方法，超滤，得到含有免疫蛋白的组分， 将含有目的蛋白的上清溶液然经过AKTA explorer 10蛋白纯化系统(SuperdexTM 200、 SuperdexTM 75)中简单的层析技术分离纯化得到目的蛋白Hemolin ;此外,本专利技术所选择的层析条件不但有效地纯化了目的蛋白Hemolin,而且有效地防止了标Hemolin的失活变性，最终制备了纯度较高的具有天然活性的Hemolin。附图说明图I是家蚕天然免疫蛋白Hemolin的弱阴离子交换柱(DEAE)初步分离色谱图； 图2A是家蚕天然免疫蛋白Hemolin的弱阴离子交换柱(DEAE)初步分离的SDS-PAGE图谱之一；其中4、5、17、21、25、32分别对应于分离得到的管子；图2B是家蚕天然免疫蛋白Hemolin的弱阴离子交换柱(DEAE)初步分离的SDS-PAGE图谱之二 ；其中37、38、63、73、75、76等等数字分别对应于分离得到的管子；图3是SuperdexTM 200分离的色谱图；图 4A 是 SuperdexTM 200 分离后的 SDS-PAGE 谱图之一;其中 23、27、31、34、39、41、44、 47分别对应于分离得到的管子；图 4B 是 SuperdexTM 200 分离后的 SDS-PAGE 谱图之二 ；其中 52、56、60、66、68、73、75 等数字分别对应于分离得到的管子；图5是将47号多次收集的样品浓缩后用SuperdexTM 75分离的色谱图；图6是为图4第一个峰浓缩后的SDS-PAGE鉴定图；图7是将图3中第一块胶的最后一条泳道中取样的质谱鉴定图(一级)；图8是将图3中第一块胶的最后一条泳道中取样的质谱图(二级)；图9是将图3中第一块胶的最后一条泳道中取样的肽段比对数。具体实施方式应该指出，以下具体说明都是事例性的，旨在对本专利技术提供进一步说明，除非另有说明，本文中使用的所有科学和技术术语具有与本专利技术所属
人员通常理解的含义相同。下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步说明。实施例I :家蚕免疫蛋白母液的制备步骤I :保存于-20°C的蚕蛹(购于浙江中奇生物药业股份有限公司)与灭菌4°C预冷的ddH20以1:3的重量百分比混合在冰上匀浆2 min,将匀浆液置于冰上停留5 min,重复9 次；步骤2 :15000 rpm, 4°C离心Ih,弃去上清,用水重悬沉淀，再于15000 rpm,4°C离心Ih, 如此重复5次，最后一次用4层纱布过滤；步骤3 :过滤后的上清液取200mL与水按I: I的体积混合,用O. 22 μ m膜包过滤,重复 10次，上清溶液恢复到200mL的体积；步骤4 :所得上清液于50000rpm, 10°C离心40min后，出现的黑团用超滤液重悬进行区带离心(50000rpm, 1(TC离心40min);取样品300ml进行鹿糖密度梯度离心3h (具体操作过程为铺制PBS (pH 7. 4的磷酸盐缓冲液)200ml，样品(步骤3所得上清液)300ml，30%(质量体积浓度)蔗糖400ml，55% (质量体积浓度)蔗糖充满，22000rpm密度梯度离心3h);步骤5 :将步骤4离心3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种家蚕天然免疫蛋白Hemolin，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种家蚕天然免疫蛋白Hemolin,其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。2.—种如权利要求I所述的家蚕天然免疫蛋白Hemolin的纯化方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤 (I)家蚕免疫蛋白母液的制备； (2)家蚕天然免疫蛋白的分离纯化。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(I)中所述家蚕免疫蛋白母液的制备具体包括 a.保存于_20°C的蚕蛹与4°C预冷的灭菌ddH20以1:3的重量百分比混合，在冰上匀衆2 min,将匀楽:液置于冰上停留5 min,重复9次； b.于15000rpm,4°C离心Ih,弃去上清,用水重悬沉淀,再于15000 rpm, 4°C离心Ih,如此重复5次，最后一次用4层纱布过滤； c.过滤后的上清液取200mL与水按I:I的体积混合,用O. 22 μ m膜包过滤,重复10次，上清溶液恢复到200mL的体积； d.步骤c所得上清液于50000rpm,10°C离心40min后，出现的黑团用超滤液重悬进行区带离心；取样品300ml进行蔗糖密度梯度离心3h; e.将步骤d离心3h后所得的上清液用质量体积浓度为60%蔗糖溶液下样，按35mL/管收集，并在每管中取3mL做比活測定。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤d中所述样品的蔗糖密度梯度离心为铺制pH 7. 4的磷酸盐缓冲液200ml，样品300ml，30%蔗糖400ml，55%蔗糖充满，22000rpm密度梯度离心3h。5.如权利要求3或4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，杜瑶瑶，刘玲玲，陈剑清，舒特俊，
申请(专利权)人：天津耀宇生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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