一种抗人降钙素原蛋白N末端抗原表位的单克隆抗体7H8的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗人PCT蛋白N末端氨基酸序列的单克隆抗体7H8的杂交瘤细胞，通过在大肠杆菌中原核表达密码子优化后的人PCT全基因序列，以纯化的人PCT蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠。经过细胞融合及筛选，获得了能够稳定分泌针对人PCT蛋白N末端抗原表位单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为7H8。7H8单克隆抗体能够应用于血清PCT浓度的检测，并且具有高度的灵敏度和特异性。7H8抗体识别人PCT蛋白N末端氨基酸序列，避免了与体内降钙素发生交叉反应，提高识别PCT蛋白的特异性，为开发PCT相应的诊断试剂提供了一种很好的新材料，可以广泛的应用于细胞生物学和免疫学试验，具有良好的应用价值。

Preparation of monoclonal antibody 7H8 against human calcitonin N terminal antigen epitope

The invention discloses a hybridoma cells secreting anti human PCT protein N terminal amino acid sequence of the monoclonal antibody 7H8, the gene sequence expressed in E.coli codon optimized PCT with the purified PCT protein as antigen to immune BALB/c mice. After cell fusion and screening, hybridoma cells stably secreting monoclonal antibodies against human PCT protein N end antigen epitope were obtained, named 7H8. 7H8 monoclonal antibodies can be applied to the detection of serum PCT concentration and have high sensitivity and specificity. 7H8 antibody of human PCT protein N terminal amino acid sequence of the peptide, avoid cross reacts with calcium in vivo, improve the specific recognition of PCT protein, provides a good new material for the development of diagnostic reagents PCT, can be widely used in cell biology and immunology test, has good application value.

【技术实现步骤摘要】
一种抗人降钙素原蛋白N末端抗原表位的单克隆抗体7H8的制备
本专利技术属于生物
，涉及一种单克隆抗体，具体涉及一种分泌抗人PCT蛋白N末端抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞及其特异性单克隆抗体的制备。
技术介绍
降钙素原（procalcitonin,PCT）来源于人第11号染色体上的降钙素I基因，该基因在甲状腺C细胞内翻译表达降钙素原前体（proprocalcitonin）后，被内源性多肽酶剪切掉N端25个氨基酸的信号肽，成为含有116个氨基酸的无激素活性的降钙素前肽物质，即为降钙素原（PCT）。PCT由N末端（1-57aa）-降钙素（60-91aa）-钙抑肽（96-116aa）三部分组成，分别由2肽（-Lys-Arg-）及4肽（-Gly-Lys-Lys-Arg-）连接，相对分子质量约为13KDa，PCT再经过一系列细胞内蛋白酶加工水解成包含32个氨基酸的具有激素活性的多肽，即为降钙素（calcitonin,CT）。目前为止，关于降钙素原的基础研究很少，其来源和病理生理作用仍未明确，在体内的生物学功能也不得而知。但是，根据PCT在血清中的含量变化与炎症反应的相关性，PCT被应用于多种临床检测和观察中。在正常生理情况下，甲状腺外的降钙素I基因表达受到抑制，仅限于在甲状腺和肺细胞中表达，因此，在健康人血中PCT含量极少，通常低于0.10ng/mL。严重真菌、细菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭等会诱导全身多种组织和细胞中的降钙素I基因表达，导致血清中PCT的含量会迅速升高，PCT浓度甚至会蹿升至正常水平的数百至万倍，但CT的含量则保持不变或略有增高。然而，过敏和病毒感染以及自身性免疫疾病不会引起血液中PCT升高，局部细菌感染和慢性炎症同样不会导致PCT水平的明显变化。因此，PCT是重要的炎症标志物，能够区分细菌感染与病毒感染、自身免疫疾病引起的炎症反应。并且，与其他的炎症指示因子相比，PCT具有更好的灵敏性和特异性。PCT在感染后2小时即可以检测到，感染后6-12小时达到峰值，12-24h为平台期，24h后浓度下降，半衰期较长，为20-24小时，能在一段时间维持在高水平。同时PCT水平与感染程度正相关，PCT浓度越高意味着受感染程度越严重，因此PCT水平对炎症的发生发展的诊断以及治疗预后等方面都具有重要意义。其他炎症因子如IL-6、IL-10、TNF-α在感染后2小时达到峰值，并迅速下降，不易被检测到；而C反应蛋白（CRP）在感染后24-48小时才达到峰值，且炎症控制后浓度仍保持较高水平，不利于早期诊断和治疗评价。在临床诊断治疗中，传统检测指标如体温、白细胞计数（WBC）的灵敏性和特异性均不高，而PCT与过去的生物学标记物相比，其具有较为理想的准确性和特异性，是一个理想的感染检测标志物，有助于临床的早期诊断和制定合理的治疗方案。PCT检测炎症的方法已获得美国食品药品管理局（FDA）的许可。早期，检测PCT主要使用凝胶层析分析法和高效液相色谱法，这两种方法不仅费时，且操作要求高，不易自动化。近年来，PCT的检测多采用免疫学方法进行，具有特异性强、灵敏度高和容易操作等优点，包括双抗夹心免疫化学发光法、胶体金法和放射免疫法等。所有这些免疫学方法的前提都是制备针对PCT的特异性单克隆抗体，在健康人血浆中PCT含量极低，在0.2ng/mL以下，因此，对所制备抗体的亲和力等参数要求很高。且目前检测体系所用的抗体均来自国外大公司，价格昂贵。因此，制备PCT特异性单克隆抗体，为PCT的免疫检测提供关键原料，对于扩大其临床应用，降低医疗成本，具有重要意义。
技术实现思路
目前，国内自主研发的针对PCT蛋白的单克隆抗体，主要是使用合成的预测表位肽段作为抗原免疫小鼠，经过杂交瘤技术获得的，使用的抗原肽段分别是34-60aa以及75-88aa序列，均与降钙素序列（60-91aa）存在交叉，因此不能够区分PCT及CT。本专利技术的目的是筛选出特异性识别PCT蛋白N末端的氨基酸序列的单克隆抗体，减少交叉反应，使其可以广泛的应用于PCT的临床检测及基础研究中。针对现有技术的不足，本专利技术经过反复试验，利用原核表达技术，表达并纯化人PCT全长蛋白，纯化后的人PCT蛋白具有很高的纯度，Westernblot实验显示该蛋白具有很强的免疫反应性。纯化后的人PCT蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选到13株分泌抗人PCT蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，经鉴定，其中1株识别的位点位于PCT蛋白N末端4-18aa序列。本专利技术对这株杂交瘤细胞（杂交瘤细胞株7H8）进行了生物学特性鉴定。本专利技术提供的技术方案是：筛选一种分泌抗人PCT蛋白N末端抗原表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞（杂交瘤细胞株7H8）已于2015年9月15日为中国典型培养物保藏中心（武汉）CCTCC所保藏（保藏地址是：中国武汉武汉大学，邮编：430072），其保藏号为CCTCCNO:C2015155，经检测存活。该细胞是圆形的半贴壁细胞（用弯管可以将细胞从瓶壁上吹下来，收集细胞不需要胰酶消化，如果有细胞悬浮存在也是正常），细胞分裂倍增的时间是16-18小时。同时，本专利技术还提供一种抗人PCT蛋白N端氨基酸序列的单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：（1）将人PCT蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，采用皮下免疫方法，以每只小鼠免疫蛋白浓度分别为30µg、50µg、100µg和150µg四个梯度的剂量，每个梯度免疫3只6~8周龄BALB/c雌性小鼠；（2）两周后进行第2次免疫，将人PCT蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，采用与步骤（1）中同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠；（3）2周后进行第3次免疫，免疫剂量与方法同第2次免疫；（4）融合前3d用不加佐剂的人PCT抗原，采用脾下加强免疫，每只剂量为100μg；（5）融合前1d用不加佐剂的人PCT抗原加强免疫，每只剂量50μg；（6）小鼠断尾进行尾尖采血，4℃，4000g离心5min，取上清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价大于1,000,000的小鼠准备进行细胞融合试验；（7）选择生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞以1:5~1:10混合，1500g离心5min，弃上清；（8）轻摇离心管使细胞均匀分散，缓缓加入1mL37℃预热的PEG1500并轻轻混匀1.5min，然后加入20mL1640培养基；（9）800g离心5min后弃上清，细胞中加入含有20%血清的HAT-1640培养基并混匀；（10）将混匀的细胞均匀铺于96孔板中，在37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养5~7d后观察融合效果并换液；（11）换液后第4d用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清液，选择阳性值高且细胞集落数目少的孔，通过有限稀释法进行亚克隆，每孔细胞数目理论值为1~2个；（12）经过3~4次亚克隆后，即获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，筛选出的阳性杂交瘤细胞可用于制备抗人PCT蛋白单克隆抗体。(13)进一步筛选和鉴定能够分泌识别的表位位于PCT蛋白的N末端氨基酸，而不识别降钙素（CT）的氨基酸序列的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术还提供所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。本专利技术还提供所述的单克隆抗体在制备PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人PCT蛋白N端氨基酸序列的单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：（1）将人PCT蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，采用皮下免疫方法，以每只小鼠免疫蛋白浓度分别为30 µg、50 µg、100 µg和150 µg四个梯度的剂量，每个梯度免疫3只6~8周龄BALB/c雌性小鼠；其中所述的人PCT蛋白由如SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列所编码；（2）两周后进行第2次免疫，将人PCT蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，采用与步骤（1）中同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠；（3）2周后分别进行第3次免疫，免疫剂量与方法同第2次免疫；（4）融合前3 d用不加佐剂的人PCT抗原，采用皮下加强免疫，每只剂量为100 μg；（5）融合前1 d用不加佐剂的人PCT抗原加强免疫，每只剂量50 μg；（6）小鼠眼角进行采血，4 ℃，4000 g离心5 min，取上清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价大于1,000,000的小鼠准备进行细胞融合试验；（7）选择生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞以1:5~1:10混合，1500 g离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清；（8）轻摇离心管使细胞均匀分散，缓缓加入1 mL 37 ℃预热的PEG 1500并轻轻混匀1.5 min，然后加入20 mL 1640培养基；（9）800 g离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清，细胞中加入含有20%血清的HAT‑1640培养基并混匀；（10）将混匀细胞均匀铺于96孔板中，在37 ℃，CO...

【技术特征摘要】
1.一种抗人PCT蛋白N端氨基酸序列的单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：（1）将人PCT蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，采用皮下免疫方法，以每只小鼠免疫蛋白浓度分别为30µg、50µg、100µg和150µg四个梯度的剂量，每个梯度免疫3只6~8周龄BALB/c雌性小鼠；其中所述的人PCT蛋白由如SEQIDNO:1所示核苷酸序列所编码；（2）两周后进行第2次免疫，将人PCT蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，采用与步骤（1）中同样的剂量和方法加强免疫BALB/c小鼠；（3）2周后分别进行第3次免疫，免疫剂量与方法同第2次免疫；（4）融合前3d用不加佐剂的人PCT抗原，采用皮下加强免疫，每只剂量为100μg；（5）融合前1d用不加佐剂的人PCT抗原加强免疫，每只剂量50μg；（6）小鼠眼角进行采血，4℃，4000g离心5min，取上清，间接ELISA法检测血清效价，选取血清效价大于1,000,000的小鼠准备进行细胞融合试验；（7）选择生长状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾脏细胞以1:5~1:10混合，1500g离心5min，收集细胞沉淀，弃上清；（8）轻摇离心管使细胞均匀分散，缓缓加入1mL37℃预热的PEG1500并轻轻混匀1.5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘如石，郑姣，李晓丹，廖旻晶，吴意，邱义兰，何赛，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43