本发明专利技术公开了一种植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒和应用。该植物乳杆菌（Lactobacillus?plantarum）定量检测方法包括：（1）提取待检样品的总RNA；（2）将提取的总RNA反转录成cDNA；（3）采用特异性扩增植物乳杆菌的引物对，以所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，其中上游引物序列如SEQ?ID?No:1所示；下游引物序列如SEQ?ID?No:2所示；（4）通过比较待检样品的Ct值和定量外标准品的标准曲线测定其中植物乳杆菌数量。本方法能够有效排除其他细菌，尤其是近缘菌的干扰，只检测样品中存活的植物乳杆菌数量。本发明专利技术所述植物乳杆菌定量检测试剂盒使用简便，检测效率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，特别是涉及一种植物乳杆菌定量检测方法，所述植物乳杆菌定量检测方法是定量荧光PCR方法，一种植物乳杆菌定量检测试剂盒及其应用。
技术介绍
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸杆菌中的一种，与人类的生活关系密切，常存在于发酵的蔬菜和果汁中。植物乳杆菌作为人体胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能，因而被广泛的作为·益生菌添加到功能性食品与保健品中。大量研究表明，只有产品中益生菌的活菌数达到I X IO6个/ML才能够发挥其应有的功效，因而益生菌活菌数量是评价益生菌制品质量的重要指标。然而目前对多菌复合产品中的植物乳杆菌的定性、定量检测方面缺乏科学、合理、快速的方法。传统生理生化方法易受选择培养基、培养条件、菌种特性等因素影响，检测效率有限，且耗时时间长，一般要2-3天；以16S rDNA序列同源性分析作为细菌系统发育和亲缘关系研究已被普遍应用于乳酸菌的分类鉴定中，但由于植物乳杆菌与戊糖乳杆菌、副植物乳杆菌等具有99%的相似性，利用该方法只能鉴定到属而无法准确到种。伴随着高通量测序技术的快速发展，大量乳酸菌菌株的基因组图谱已被解析。这些基因组数据可以使我们了解不同益生菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为不同种乳酸菌的区分和鉴定奠定了基础。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题就是针对现有的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的菌数检测方法易受培养基、培养条件、菌种特性等因素影响，并且检测耗时时间长，检测效率较低的缺陷，提供一种植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒和应用。本专利技术所述植物乳杆菌定量检测方法及其检测试剂盒灵敏度高，特异性强，稳定性好，操作简单、迅捷，能极大提高乳制品中乳杆菌数量的检出效率。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之一为一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)定量检测方法,其中所述方法包括以下步骤(I)提取待检样品的总RNA ；(2)将步骤(I)提取的总RNA反转录成cDNA ；(3)采用特异性扩增植物乳杆菌的引物对，以步骤(2)所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测，其中所述特异性扩增植物乳杆菌的引物对为上游检测引物，其序列如序列表中SEQ ID No:1所示;下游检测引物，其序列如序列表中SEQ ID No:2所示；(4)通过比较待检样品的Ct值和定量外标准品的标准曲线测定样品中植物乳杆菌的数量。本专利技术所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)也可简写为植物乳杆菌(L. plantarum),其余乳杆菌命名规则与之相同。其中步骤(I)所述提取待测样品总RNA的方法为本领域常规的总RNA提取方法。所述总RNA的提取较佳地为通过本领域各种商用的RNA提取试剂盒进行。其中步骤(2)所述RNA反转录成cDNA的方法为本领域常规的反转录方法。所述反转录较佳地为利用各种商用反转录试剂盒进行。其中步骤(3)所述特异性扩增植物乳杆菌的引物对包括上游测序引物和下游测序引物，其中上游测序引物5’ -GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’，其序列如序列表中SEQ IDNo:1所示；下游检测引物5 ’ -AATACAAGCAAGTCTTGGA CCAG-3 ’，其序列如序列表中SEQ IDNo: 2所示。所述引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为通过人工合成途径即得，可以委托服务商进行全序列合成即得。其中步骤(3)所述荧光定量PCR扩增为本领域常规的荧光定量PCR扩增技术。所述荧光定量PCR程序较佳地为(1)94°C 95°C，25 30秒；(2)94°C 95°C，5 15秒，(3) 60°C，20 30秒，其中步骤(2) (3)重复30 45个循环，更佳地为(I) 95°C 30S ;(2)95°C 5S，(3) 60°C 25S，步骤(2) (3)重复 40 个循环；4°C保存。其中步骤(3)所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)为本领域常规的植物乳杆菌。本专利技术所述植物乳杆菌较佳地选自植物乳杆菌(L. plantarum) ST-1I1、植物乳杆菌(L. plantarum)WCFSl、植物乳杆菌(L. plantarum)P8 和植物乳杆菌(L. plantarum)CCTCCNo. M206033中的一种或几种。其中步骤(4)所述的定量外标准品较佳地为植物乳杆菌(L. plantarum)ATCC14917的总RNA反转录后所得的总cDNA，其中所述标准曲线较佳地是将外标准品采用10倍梯度水稀释，以稀释后的外标准品作为底物进行定量PCR反应得到Ct值，根据稀释后标准品的拷贝数和其相对应的Ct值绘制而得。荧光染料产生的荧光信号可以被荧光定量PCR仪内的荧光信号采集系统检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量成正比例关系。对植物乳杆菌的定量可以通过与定量标准品的循环阈值(Ct，Thresho I d Cyc I e )相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数。Ct值与起始模板数成一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多；相反，Ct值越大，起始模板数越少。因此，利用梯度稀释标准品的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可以准确测出该样品的起始拷贝数。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之二为一种特异性扩增植物乳杆菌的引物对，所述引物对中的上游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:1所示；其中下游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:2所示。其中所述特异性扩增植物乳杆菌的引物对的序列分别为上游测序引物5’ -GGAGCCGCTATTAGTATTTTCAT-3’，其序列如序列表中SEQ IDNo:1所示；下游检测引物5 ’ -AATACAAGCAAGTCTTGGACCAG-3 ’，其序列如序列表中SEQ IDNo: 2所示。所述引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为通过人工合成途径即得，可以委托服务商进行全序列合成即得。为解决上述技术问题，本专利技术采取的技术方案之三为一种植物乳杆菌定量检测试剂盒，所述定量检测试剂盒包括SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、无菌双蒸水，上游检测引物和下游检测引物，其中所述上游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:1所示，所述下游检测引物的序列如序列表中SEQ ID No:2所示。其中所述SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、DNA聚合酶、无菌双蒸水均为本领域常规实验试剂，均市售可得。其中所述植物乳杆菌定量检测试剂盒，较佳地还包括定量外标准品。所述定量外标准品是本领域常规的外标准品，较佳地是植物乳杆菌ATCC14917的总RNA反转录后所得总 cDNAo其中所述植物乳杆菌定量检测试剂盒，较佳地还包括RNA提取试剂和/或反转录试剂。所述RNA提取试剂较佳地为Trizol、RNA酶抑制剂。其中所述反转录试剂较佳地为逆转录酶(AMV)、AMV缓冲液。其中所述AMV缓冲液较佳地包括dNTPs、随机引物、RNA酶抑本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植物乳杆菌（Lactobacillus?plantarum）定量检测方法，其特征在于，所述植物乳杆菌定量检测方法包括以下步骤：（1）提取待检样品的总RNA；（2）将步骤（1）提取的总RNA反转录成cDNA；（3）采用特异性扩增植物乳杆菌的引物对，以步骤（2）所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测，其中所述特异性扩增植物乳杆菌的引物对为：上游检测引物，其序列如序列表中SEQ?ID?No:1所示；下游检测引物，其序列如序列表中SEQ?ID?No:2所示；（4）通过比较待检样品的Ct值和定量外标准品的标准曲线测定样品中植物乳杆菌的数量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈臣，任婧，周方方，艾连中，
申请(专利权)人：光明乳业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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