本发明专利技术公开了一种生物样品中待检物的夹心免疫PCR检测方法和试剂盒，所述方法包括以下步骤：1）第一抗体或受体的固定；2）特异性捕捉样品中的待检物；3）连接第二抗体或受体，其中，所述第二抗体或受体标记有第一核苷酸序列；4）杂交：将与所述第一核苷酸序列具有互补的第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列杂交；5）转移：采用酶切或置换核酸的方法，将所述第二核苷酸序列分离并转移到PCR管中；6）检测：定量PCR检测所述PCR管中第二核苷酸序列的含量，该含量反应了所述待检物的含量。所述试剂盒包含所述检测方法所涉及的主要成分。本发明专利技术具有操作简单，检测准确性高的有益效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物样品中待检物的检测技术，尤其涉及一种生物样品中待检物的夹心免疫PCR检测方法和试剂盒。
技术介绍
Y干扰素是一种具有多种功能的免疫活性蛋白，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和控制细胞凋亡等作用。干扰素及相关细胞因子的作用一直是生物医学研究的热点。然而干扰素体内生物学作用很大但含量非常低，正常人血液内每毫升只有几个皮克，甚至更低。因此，研究专利技术一种高效、便捷、准确、成本低的监测手段显得非常重要。目前，常用的检测Y 干扰素的方法有仪器分析法和免疫检测法。仪器分析法主要包括高效液相色谱法(HPLC)和质谱，灵敏度很高，但它需要昂贵的仪器设备，耗材要求高及样本预处理，在专业人员的操作下才能进行。这类仪器分析法已经不能达到现代检测对快速、方便、成本低的要求。免疫分析方法通常是指通过抗体与抗原的特异性特点用抗体(或抗原)来检测抗原(或抗体)的检测方法。这种特异性相互识别不限于抗原与抗体，受体与配体，酶与底物， 凝集素与多糖也适用。免疫检测的经典方法是酶联免疫吸附法(ELISA)。传统ELISA通过抗原非特异地结合到固相支持物上，实现了被检抗原从溶液中转移。洗涤去除多余的(未结合的)抗原后，封闭板孔。然而，在固相支持物上，固定的抗原与抗体连接形成一个免疫复合物，洗涤去除未结合的抗体，酶可以直接连接到抗体上，再通过酶联检测一抗。或者添加随后与板连接的二抗。连接到固相支持物的酶活性与固定在固相支持上的抗原呈一定的比例关系，例如，可以通过一种显色基质和酶的作用，计算支持物上抗原的含量。该方法简单，经济，专一性好，而且已广泛采用自动化操作。但其检测灵敏度低，对干扰素和细胞因子的常规检出效果很差。而聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction缩略词为PCR)技术有很高的检测灵敏度，为了增强ELISA的灵敏度，免疫PCR运用而生。免疫PCR(Immun0-PCR，IPCR) 最早是由Sano等人提出，与间接ELISA类似，不同的是免疫PCR使用一段DNA链作为检测分子替代了 ELISA反应中的酶。文献显示Sano等人通过BSA与抗BSA抗体反应证实了免疫组化的效果，其通过蛋白A-亲和素连接系统将生物素标记的质粒DNA标记到一抗上，随后PCR扩增与抗原连接的DNA分子，扩增30个循环，EB染色，接着凝胶电泳分析。此方法与ELISA比，免疫PCR显著提高了检测灵敏度。这灵敏度可以通过纯化系统来验证，但由于其存在过程繁琐，步骤多的特点，很难在实际的医学研究中运用。采用‘夹心’式的方法执行免疫PCR，即包被抗体在固相支持物上如微孔板、磁珠颗粒，捕获样品中的抗原，紧接着添加检测抗体，检测抗体上标记有报告分子如放射性同位素、荧光素、DNA和酶，这产生 了一个特殊的免疫复合物(抗体-抗原-抗体复合物)固定在固相支持物表面，反复洗涤固相支持物表面，去除未结合的抗原-抗体。在洗涤步骤中， 保持免疫复合物的完整性很重要，以致使信号强度最大化，由此最大限度的降低背景。在洗涤后，通过检测报告分子来定量这个固定的‘检测’抗体。报告分子的量能显示出抗原的存在量。当这个检测系统是足够灵敏时，系统的最低灵敏度通常由游离‘检测’抗体非特异结合所产生背景的程度决定的。在诊断和生物科学领域，需要一个强有力的检测方法去分析一些低水平(低浓度) 存在的物质，且随着人类基因组测序和分析的完成，这种需求变得越来越迫切。这些蛋白应该被分析和定性，但是使用当前的检测技术不能量化这些蛋白。免疫PCR做为一种高灵敏度的检测方法，为物质高灵敏检测提供了一个保证，但目前为止，传统ELISA存在灵敏度低，传统免疫PCR操作复杂且背景偏高，导致只能检测一部分物质，因此，很有必要开发新的技术来解决这些问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种生物样品中待检物的夹心免疫PCR检测方法和试剂盒，提高检测灵敏度，降低操作要求。本专利技术的技术问题通过以下技术手段予以解决一种生物样品中待检物的夹心免疫PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)第一抗体或受体的固定在支持物上连接生物样品中待检物的第一抗体或受体；2)特异性捕捉生物样品使生物样品中的待检物通过一个连接位点与所述第一抗体或受体结合；3)连接第二抗体或受体将待检物的第二抗体或受体连接到所述待检物的另一个连接位点上，其中，所述第二抗体或受体标记有第一核苷酸序列；4)杂交将与所述第一核苷酸序列具有互补的第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列杂交； 5)转移采用置换或酶切核酸的方法从所述支持物上洗脱所述第二核苷酸序列并转移到PCR管中；6)检测定量PCR检测所述PCR管中第二核苷酸序列的含量，该含量反应了所述生物样品中待检物的含量。优选地所述第一核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列5 ; -aagctcgatatcagagga aggaggagggac-3 '；所述第二核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO. 2所示的序列5' -tccttcctctgatatcga gettggcgtaatcagggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccg gaagcataaagtgtaaagcctgaagtgcctaatgagtg-3 } 0所述步骤5)中采用置换方法从所述支持物上洗脱所述第二核苷酸序列包括采用与所述第一核苷酸序列互补的置换核酸分子与所述第二核苷酸序列进行置换，所述置换核酸分子为具有序列表SEQ ID NO. 5所不序列的DNA序列或所述置换核酸分子为具有序列表SEQ ID NO. 6所示序列的肽核酸,序列表SEQ ID NO. 5所示序列为5 ' -gtccctcctccttc ctctgatatcgagctt-3 ',序列表 SEQ ID NO. 6 所不序列为5 ' -tccttcctctgatatcgagctt -3丨;或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列中均包含酶切位点，所述步骤5)中采用酶切方法从所述支持物上洗脱所述第二核苷酸序列采用限制性内切酶进行洗脱。所述待检物为人Y干扰素。—种生物样品中待检物的夹心免疫PCR检测试剂盒，其特征在于包括支持物；待检物的第一抗体或受体；待检物的第二抗体或受体，该第二抗体或受体标记有第一核苷酸序列；单链DNA片段，该单链DNA片段具有与所述第一核苷酸具有互补的第二核苷酸序列； 以及酶切试剂或与所述第一核苷酸序列互补的置换核酸分子；所述酶切试剂包括酶解反应液和酶解反应终止液优选地所述第一核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列；所述第二核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO. 2所示的序列。所述置换核酸分子为具有序列表SEQ ID NO. 5所示序列的DNA序列或所述置换核酸分子为具有序列表SEQ ID NO. 6所示序列的肽核酸。与现有技术相比，本专利技术在生物样品中待检物的免疫PCR检测过程中采用DNA杂交、复合物转移技术，通过将杂交的单链DNA片段释放出来，而非特异性结合的单链DNA片段依旧留着原有支持物上，显著降低了实验背景，大幅提高了人Y干扰素检测的灵敏度， 传统ELISA方法最低检测限量一般在5pg/mL左右，线性范围l(Tl本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生物样品中待检物的夹心免疫PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）第一抗体或受体的固定：在支持物上连接生物样品中待检物的第一抗体或受体；2）特异性捕捉生物样品：使生物样品中的待检物通过一个连接位点与所述第一抗体或受体结合；3）连接第二抗体或受体：将待检物的第二抗体或受体连接到所述待检物的另一个连接位点上，其中，所述第二抗体或受体标记有第一核苷酸序列；4）杂交：将与所述第一核苷酸序列具有互补的第二核苷酸序列与所述第一核苷酸序列杂交；5）转移：采用置换或酶切核酸的方法从所述支持物上洗脱所述第二核苷酸序列并转移到PCR管中；6）检测：定量PCR检测所述PCR管中第二核苷酸序列的含量，该含量反应了所述生物样品中待检物的含量。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴庆军，周翔，阳云，
申请(专利权)人：深圳市达科为生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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