嗜水气单胞菌核酸标准品的应用制造技术

本发明专利技术公开一种嗜水气单胞菌核酸标准品的应用，其包括下述步骤：采用CTAB法提取样品的核酸；以嗜水气单胞菌核酸标准品作为阳性对照，对提取的样品核酸进行PCR特异性扩增；对PCR特异性扩增产物进行电泳，对比样品和阳性对照的结果判断结果；其中阳性对照通过将提取的嗜水气单胞菌ATCC?35654和/或嗜水气单胞菌ATCC?7966的基因组核酸冷冻干燥获得基因组核酸标准样品，于-20℃中避光贮存。本发明专利技术产品适用于水生动物的疾病预防；制备成本低，保存时间长，无污染。对解决大批量水生动物养殖的嗜水气单胞菌的防治具有重要的现实意义。

【技术实现步骤摘要】
嗜水气单胞菌核酸标准品的应用
本专利技术主要涉及海产品疾病检测
，具体涉及一种嗜水气单胞菌核酸标准品的应用。
技术介绍
我国海域辽阔，自然条件优越，海洋资源十分丰富。但目前开发利用的程度还很低。这也说明我国开发利用海洋资源的潜力巨大，辽宁海域是中国重要的海洋生物资源、渔业资源宝库，其盛产水生动物、扇贝、贻贝、牡蛎和鱼、虾以及藻类等，带动海洋经济发展。加强多边和双边的海洋开发国际合作，集中集约开发利用海域及海岛资源，合理配置优势海洋产业，科学高效开发海洋资源，积极开展科研与试验、开发与利用，海水养殖标准化是合理开发海水养殖资源的重要手段，研究制定海产品养殖标准，合理开发海水滩涂养殖资源， 提高养殖海产品疾病是当今养殖业的重点内容。海产品养殖是一项高风险的养殖业，传统的小户的海产品养殖给养殖户带来了巨大的市场和技术风险。为了将养殖户养殖风险降到最低，开展对各类养殖业，包括鱼、虾、蟹、水生动物、鲍鱼、贝类、海藻等各类海产品的疾病防治工作任务举足轻重。有报道称，霍乱弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌等有害细菌，是引起海产品各种疾病的罪魁祸首。 嗜水气单胞菌(A. hydrophila)广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌。该菌是弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，极端单鞭毛，没有芽胞和荚膜，刚从病灶上分离的病原菌常两个相连。在普通琼脂平板培养基上进行培养形成的菌落园形、边缘光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略带淡桃红色有光泽，发育良好。嗜水气单胞菌在水温14. O 40. 5°C范围内都可繁殖，以28. O 30. (TC为最适温度。PH值在6 11范围内均可生长；最适PH值为7. 27 ;嗜水气单胞菌可在含盐量0%。 4%。的水生存，最适盐度为O. 5%。。嗜水气单胞菌可以产生毒性很强的外毒素，因嗜水气单胞菌的变异菌株较多，所以要特别注意疗效。
技术实现思路
由
技术介绍
可见，提高嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的检出率,增强其检测精度是解决多种水生动物病害问题的重要途径。本研究采用以下技术方案实现嗜水气单胞菌核酸标准品的应用，其包括下述步骤采用CTAB法提取样品的核酸；以嗜水气单胞菌核酸标准品作为阳性对照，对提取的样品核酸进行PCR特异性扩增^PCR特异性扩增产物进行电泳，对比样品和阳性对照的结果判断结果；所述嗜水气单胞菌核酸标准品的制备方法包括以下步骤将提取的嗜水气单胞菌ATCC 35654和/或嗜水气单胞菌ATCC 7966的基因组核酸经冷冻干燥后获得，其中所述的冷冻干燥条件为启动冻干机，当干燥室温度降至_35°C 时开启冷却阱；冷却阱温度降至_40°C时，将在_80°C预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空；待真空度降至O. 5Torr结束冷冻；并将样品于15°C干燥，当真空度降至O.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得基因组核酸标准样品，于_20°C中避光贮存。对于上述技术方案中所述的样品的核酸提取方法，可以由本领域技术人员根据共知常识确定。在上述技术方案中，所述的提取样品核酸的方法为步骤(3)，所述嗜水气单胞菌核酸标准品的制备方法包括以下步骤(I)增菌从嗜水气单胞菌标准菌株接种到普通LB培养基中，进行发酵，37°C培养12h制得发酵产物；将发酵产物再接入嗜水气单胞菌培养基中进行发酵，32 37°C培养 24 48h，至菌悬液菌含量的终浓度为IO7 101QCfu/g ；所述的嗜水气单胞菌培养基，其配制方法如下胰 蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠IOg,葡萄糖5g,无需调节pH, 121°C下灭菌20min ;冷却备用；(2)洗涤将步骤(I)获得的菌悬液重复下述操作2飞次以清洗，以1:10的体积比与PBS缓冲液充分混合，在800(Tl2000rpm条件下离心5 lOmin，收集菌体；(3)采用CTAB法提取菌悬液DNA ;将提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，获得基因组核酸溶液；其操作步骤参见国家海洋局908专项办公室编，海洋生物生态调查技术规程，海洋出版社，2006、4，p23-26，于西林瓶中分装核酸样品；(4)冷冻干燥启动冻干机，当干燥室温度降至_35°C时开启冷却阱；冷却阱温度降至_40°C时，将在_80°C预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空；待真空度降至O. 5Torr 结束冷冻；并将样品于15°C干燥，当真空度降至O.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得基因组核酸标准样品，于-20 V中避光贮存。对于以上所述的所有技术方案中，所述的嗜水气单胞菌标准菌株为嗜水气单胞菌 ATCC35654和/或嗜水气单胞菌ATCC 7966 ；对于以上所述的所有技术方案中，较优的条件如下提取的DNA用紫外分光光度计测260nm和280nm处的光密度值，当0D26(l/0D28(l比值在1. 7 1. 9之间较佳；对于以上所述的所有技术方案中，较优的条件如下所述的PCR特异性扩增的条件为上游引物5 ’ -GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3，下游引物5 ’ -CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3PCR 扩增反应体系(25 μ L)为:2· 5μ L 的 IOX 缓冲液 Buffer ;1μ L 的MgC12 ;1μ L 的 dNTPMix ;lyL 的引物 Pl (20mM) ;1 μ L 的引物 P2 (20mM) ;0· 2 μ L 的 TaqDNA 聚合酶； 18. 3 μ L超纯水；PCR反应条件为94°C预变性IOmin ;然后94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 45s，循环30次；并于72°C延伸IOmin ；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，电压6V/cm，电泳20分钟。本专利技术中，上述产品制备方法中，均未限定方法的其他等效条件，因其可根据现有技术确定，也未限定所用试剂的级别，因其对结果影响小，并可以通过配制或商业途径购买获得，技术人员可以依据实施例中所列条件做参考依据进行调整。这些关于制剂方式和方法的选择，相信本领域技术人员可以从现有技术中得到充分的启示，本专利技术不再赘述。本专利技术的优点是适用于水生动物的疾控或检测；本标准品的处理过程简单，耗时少；制备成本低，本专利技术粉剂保存时间长，不易污染。本专利技术对解决水生动物养殖的嗜水气单胞菌病的防治具有重要的现实意义。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1嗜水气单胞菌标准菌株选择嗜水气单胞菌ATCC 35654 ；(I)增菌从嗜水气单胞菌标准菌株接种到LB培养基中，进行发酵，37°C培养1此制得发酵产物；将发酵产物再接入嗜水气单胞菌培养基中进行发酵，37°C培养48h，至菌悬液菌含量的终浓度为109cfu/g ；所述的嗜水气单胞菌培养基配制方法胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g， 葡萄糖5g,无需调节pH, 121°C下灭菌20min ；(2)洗涤将步骤(I)获得的菌悬液重复下述清洗操作3次，以1:10的体积比与 PBS缓冲液充分混合,在12000rpm条件下离心5min,收集菌体； (3 )采用CTAB法提取菌悬液DNA取菌体加ρΗ8· O的TE悬浮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种嗜水气单胞菌核酸标准品的应用，其特征在于，其包括下述步骤：CTAB法提取样品的核酸；以嗜水气单胞菌核酸标准品作为阳性对照，对提取的样品核酸进行PCR特异性扩增；对PCR特异性扩增产物进行电泳，对比样品和阳性对照的结果判断结果；所述嗜水气单胞菌核酸标准品的制备方法包括以下步骤：将提取的嗜水气单胞菌ATCC?35654和/或嗜水气单胞菌ATCC?7966的基因组核酸经冷冻干燥后获得，其中所述的冷冻干燥条件为：启动冻干机，当干燥室温度降至?35℃时开启冷却阱；冷却阱温度降至?40℃时，将在?80℃预冻2h的核酸样品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0.5Torr结束冷冻；并将样品于15℃干燥，当真空度降至0.1Torr时，取出样品，盖紧西林瓶获得基因组核酸标准样品，于?20℃中避光贮存。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王忠举，
申请(专利权)人：王忠举，
类型：发明
国别省市：