嗜水气单胞菌适体及其筛选方法与应用技术

本发明专利技术涉及嗜水气单胞菌适体及其筛选方法与应用。提供嗜水气单胞菌适体以及所述嗜水气单胞菌适体的筛选方法与应用。所述嗜水气单胞菌适体的筛选方法的具体步骤包括：构建并合成待筛选的嗜水气单胞菌适体ssDNA文库，并设计合成相应的引物；取适量所述ssDNA文库与嗜水气单胞菌进行结合；分离获得与嗜水气单胞菌结合的ssDNA，以该ssDNA为模板进行PCT扩增，扩增产物再次进行SELEX筛选直至获得相应适体。本发明专利技术采用SELEX技术筛选出致病性嗜水气单胞菌的高亲和力寡核苷酸适体，所述适体可广泛应用于嗜水气单胞菌的检测与分析。

【技术实现步骤摘要】
嗜水气单胞菌适体及其筛选方法与应用
本专利技术涉及水产养殖中常见的致病病原菌——嗜水气单胞菌，特别涉及嗜水气单胞菌适体及其筛选方法与应用。
技术介绍
嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）在自然界分布广泛，是多种水生动物的原发性致病菌，可产生多种致病因子，对水产动物，畜禽和人类均有致病性，可引起多种动物的败血症和人类腹泻，给人类健康带来了威胁，同时也给养殖业造成较大的经济损失（1.张翠娟，于宙亮，赵宝华，何宏轩．嗜水气单胞菌研究进展[J].中国兽医杂志，2008,42（7）：46-50.）。因此，对于作为水源污染指示菌的嗜水气单胞菌污染，其检测力度仍需进一步加强。目前嗜水气单胞菌的检测一直是个棘手的问题，传统的化学病理检测过程繁琐，耗费时间；酶联免疫、多重PCR技术则成本过高（2.王利．鱼类嗜水气单胞菌的几种检测方法[J]．内陆水产，2006,（2）：22-23．）。因此，开发一种操作简便，成本低廉，快速方便的嗜水气单胞菌检测方法，成为本领域技术人员迫切需要解决的技术难题。SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)即指数富集配体系统进化技术，是1990年由美国的Tuerk和Gold创建的一种体外合成筛选寡核苷酸适体的化学组合技术（3.孟庆玲，陈创夫．SELEX技术及其应用前景[J]．塔里木大学学报，2008，20(3):44-48．4.廖世奇，刘巍，王黎．SELEX技术应用研究进展[J]．甘肃医药，2009，(02)：96-97．）。由于适体具有特异性高、库容量大、合成时间短（5.王聪艳，孙伟，李建国，等．SELEX技术应用研究进展[J]．生物技术通报，2006，(S1)：232-236．）等优点，SELEX技术现在广泛应用在疾病防控、药物筛选、临床诊断等不同的
，随着技术的不断创新与发展，逐渐产生了一些新的SELEX筛选方法，如导向SELEX技术、复合靶分子SELEX技术、基因组SELEX技术等新的研究手段（6.孟庆玲，陈创夫．SELEX技术及其应用前景[J]．塔里木大学学报，2008，20(3):44-48．）。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供嗜水气单胞菌适体。本专利技术的第二目的在于提供所述嗜水气单胞菌适体的筛选方法。本专利技术的第三目的在于提供所述嗜水气单胞菌适体在检测述嗜水气单胞菌中的应用。所述嗜水气单胞菌适体的核酸序列如序列表中1-22号中的序列所示。所述嗜水气单胞菌适体的筛选方法是将指数富集配体系统进化技术（即SELEX筛选）应用于嗜水气单胞菌适体的筛选，所述SELEX筛选的具体步骤包括：1）构建并合成待筛选的嗜水气单胞菌适体ssDNA文库，并设计合成相应的引物；2）取适量所述ssDNA文库与嗜水气单胞菌进行结合；3）分离获得与嗜水气单胞菌结合的ssDNA，以该ssDNA为模板进行PCT扩增，扩增产物再次进行SELEX筛选直至获得相应适体。在步骤1）中，所述ssDNA文库可为：：5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3′。所述引物可为：引物Ⅰ：5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3′；引物Ⅱ：5′-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3′；引物Ⅲ：5′-地高辛-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3′；引物Ⅳ：5′-生物素-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3′。在步骤3）中，所述SELEX筛选共进行12轮。本专利技术采用SELEX技术筛选出致病性嗜水气单胞菌的高亲和力寡核苷酸适体，所述适体为嗜水气单胞菌的快速检测技术的开发以及在水产病害控制方面的应用提供参考，可广泛应用于嗜水气单胞菌的检测与分析。附图说明图1为PCR产物3%琼脂糖凝胶电泳图。在图1中，M为50bpDNAmarker，1、3、5、7、9、11、12分别表示第1、3、5、7、9、11、12轮的PCR产物。图2为适体与嗜水气单胞菌结合的吸光度。在图2中，横坐标为筛选轮数，纵坐标为A450nm时的吸光度。图3-图5为本专利技术所筛选的核酸适体二级结构图。图3中的结构最小自由能为-7.60千卡/摩，图4中的结构最小自由能为1.83千卡/摩，图5中的结构最小自由能为-3.11千卡/摩。具体实施方式一、ssDNA文库及引物的合成参照文献（7、刘丰伟，兰小鹏．体外筛选铜绿假单胞菌适体的研究及初步应用[D]．福州福建医科大学，2007．）中公开的方法，用于SELEX筛选的随机ssDNA文库和引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。所用文库为：5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-N35-TTCGACATGAGGCCCGGATC-3′。所用引物分别为：引物Ⅰ：5′-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3′；引物Ⅱ：5′-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3′；引物Ⅲ：5′-地高辛-GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAA-3′；引物Ⅳ：5′-生物素-GATCCGGGCCTCATGTCGAA-3′。上述引物在合成后用分子生物学中常用的TE缓冲液（pH8.0）稀释至浓度为10μmol，-20℃保存备用。二、实验试剂及缓冲液制备Dynabeads链酶亲和素磁珠M-280试剂盒、2×TaqPCRMasterMix、50bpDNALadderMarker、牛血清白蛋白（BSA）均购自厦门鹭隆生物技术有限公司，PCR胶回收纯化试剂盒购自omega公司，抗地高辛碱性磷酸酶购自Roche公司，对硝基苯磷酸二钠为Amresco公司产品。缓冲液参照参考文献(刘丰伟，兰小鹏．体外筛选铜绿假单胞菌适体的研究及初步应用[D]．福州福建医科大学，2007．)配制。三、菌种：嗜水气单胞菌AS1.1801购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。四、SELEX筛选取一定量随机ssDNA文库（首轮筛选用量为600pmol，随后每轮减少用量），加入600μL选择缓冲液稀释ssDNA，于95℃变性5min，冷却10min。加入30μL的嗜水气单胞菌菌悬液（菌的数量约为1.5×108个），混匀置摇床室温结合30min，15000r/min，4℃下离心10min。之后弃上清液，加入600μL选择缓冲液重悬，如此重复洗涤3次，洗去未与嗜水气单胞菌结合的ssDNA，结合了ssDNA的嗜水气单胞菌沉淀用100μLddH2O重悬，96℃加热5min，离心后取上清为模板，用引物Ⅰ、Ⅳ进行PCR扩增，获得标记生物素的双链DNA（dsDNA），利用M-280磁珠通过生物素－链亲和素之间的相互作用分离ssDNA，作为下一轮筛选的次级库。依照上述方法，对次级库再次进行SELEX筛选，先后进行12轮SELEX筛选。五、各轮适体与嗜水气单胞菌结合率的测定以及适体的序列测定与分析将第1、3、5、7、9、11、12轮SELEX筛选的产物（即该轮的洗脱上清），用引物Ⅲ和引物Ⅳ进行PCR扩增，各轮均扩增320μL。PCR扩增体系为：2×TaqPCRMasterMix10ul，上游引物(10um)、下游引物(10um)各0.4ul，模板1ul，用去离子水补足到20ul。P本文档来自技高网...

【技术保护点】
嗜水气单胞菌适体，其特征在于，其序列如序列表中18号所示。

【技术特征摘要】
1.嗜水气单胞菌适体，其特征在于，其序列如GGGAGCTCAGAATAAACGCTCAATGGTGTTTGGTTGTTTTGTTTGGTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李元跃，王雷，段博文，陈融斌，黎中宝，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：