一种脂肪肉瘤鉴别诊断试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种利用DDIT3荧光探针制备的荧光原位杂交检测的试剂盒，还涉及其DDIT3荧光探针的制备方法，本发明专利技术的DDIT3荧光探针及相应的试剂盒可用于脂肪肉瘤的鉴别诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用DDIT3荧光探针制备的荧光原位杂交检测的试剂盒，还涉及其DDIT3荧光探针的制备方法，本专利技术的DDIT3荧光探针及相应的试剂盒可用于脂肪肉瘤的鉴别诊断。
技术介绍
脂肪肉瘤(Iiposarcomas)是一种常见的恶性软组织肿瘤,起源于脂肪母细胞向脂肪细胞分化的间叶细胞，故表现为不同分化程度的异型脂肪母细胞，均含有脂质。根据细胞成分的不同，脂肪肉瘤又可分为①高分化脂肪肉瘤，也称脂肪瘤样脂肪肉瘤粘液型脂肪肉瘤；③圆细胞型脂肪肉瘤；④多形型脂肪肉瘤；⑤未分化型脂肪肉瘤，但肿瘤中通常·是多型细胞混合存在。本病多见于30 70岁患者，以50岁左右发病最多。男性多于女性。四肢特别是大腿、臀部好发，上肢、腹膜后、头、颈块，直径3 IOcm多见，后腹膜巨大者直径可达20cm以上，肿瘤常为结节状，或分叶状，质软或稍硬。本病进展相对缓慢，很少发生转移，手术切除可延长病人生命。分化型及粘液型脂肪肉瘤预后较好，5年生存率可达80%左右，多形型、圆细胞型、去分化型脂肪肉瘤预后差，5年生存率20% 50%。转移以血行转移为主，多转移到肺。肉瘤分类与临床预后和治疗反应相关，对于患者的治疗非常重要。尤因肉瘤(Ewing sarcoma)和横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)对长春新喊/放线菌素D/环憐酰胺加异环磷酰胺/依托泊苷反应效果好。滑膜肉瘤对阿霉素和异环磷酰胺反应效果好，而黏液样脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma)优先与 trabectedine (ET-743, Yondelis,PharmaMar与Johnson&Johnson药厂研发)反应。临床需要将脂肪肉瘤与恶性纤维组织细胞瘤中的普通型和粘液型以及横纹肌肉瘤中的多形型进行鉴别。一般认为恶性纤维组织细胞瘤，来源于未分化的间充质细胞，并分化为纤维细胞和组织细胞，是最常见的软组织恶性肿瘤之一。横纹肌肉瘤是软组织肉瘤中恶性程度较高的，按多形性、胚胎性和腺泡性的顺序恶性程度依次增高。横纹肌肉瘤是小儿软组织肉瘤中最多见的一种，占小儿恶性实体瘤的10%。横纹肌肉瘤是20岁以下病人软组织中最常见的肉瘤。目前进行脂肪肉瘤鉴别诊断主要依靠病理学诊断。但因大约10%的肉瘤处于低分化，依靠传统的组织和免疫学方法无法分类，结果使患者很难得到最佳的治疗。如，恶性纤维组织细胞瘤与多形性脂肪肉瘤的鉴别诊断，后者无分层改变，但有成脂细胞和脂细胞的分化。在恶性纤维组织细胞瘤中也可能存在胞浆内空泡，但在成脂细胞中，空泡能向细胞核和周围转移，并使核变平，另外，在恶性纤维组织细胞瘤细胞形成的空泡中含有粘多糖物质。由于两种肿瘤(前者和多形性脂肪肉瘤)的脂质染色均为阳性，故对鉴别诊断无任何意义。手术中横纹肌肉瘤的形态无明显特征，很像高度软组织肉瘤。随着分子技术的发展，在软组织肿瘤中已经鉴别出许多遗传改变，这成为了肿瘤辅助诊断和分类的新的生物标志物，对于祀向治疗也产生积极意义。DNA 损伤诱导转录因子(DNAdamage inducible transcript 3，DDIT3，也叫 CHOP)位于12号染色体长臂I区3带，与其相关的染色体重排在黏液样脂肪肉瘤(MLS)、圆细胞脂肪肉瘤(round cell liposarcomas,RCLS)和混合型脂肪肉瘤(mixed liposarcomas)中常见。而其中的一种易位t(12;16)(ql3;pll)被认为是上述类型脂肪肉瘤的核型标志，出现在超过95%的病例中。这个易位形成FUS/DDIT3融合蛋白；在少数病例中也发现t (12 ;22) (ql3 ；ql2)染色体易位，形成EWS/DDIT3融合蛋白。FUS/DDIT3融合基因的出现对于MLS是敏感和特异的指标。在其他形态学上相似的肿瘤中不出现，如腹膜后粘液变为主的高分化脂肪肉瘤和粘液纤维肉瘤。综上，DDIT3重排作为MLS、RCLS及混合型脂肪肉瘤的特异标志，有望成为肿瘤鉴别诊断的生物标志物。但该基因的检测方法目前仅停留在试验室阶段，国内市场无灵敏度高、特异性好的检测试剂。荧光原位杂交技术基于碱基互补原则，用已知序列标记DNA探针与载玻片上的待测DNA/RNA互补杂交，在荧光显微镜下检测杂交信号判断结果。FISH技术将细胞遗传学和分子生物学改变联系起来，让微小的基因改变显现于肉眼之下，拓展了细胞遗传学检测的范围，显著提高了其识别异常染色体的能力。目前已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等检测。本专利技术利用荧光原位杂交技术，以DDIT3基因断裂区两端为靶标，分别设计并制备荧光探针。利用探针实现对DDIT3基因重排的检测，有助于脂肪肉瘤的鉴别诊断，通过准确诊断，达到及时准确治疗的目的。本专利技术提供了一种脂肪肉瘤分子标志物DDIT3探针的制备方法，并在此基础上利用探针自主研制了 DDIT3基因断裂检测试剂盒，填补了国内该检测领域的空白，具有十分重大的意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供DDIT3基因探针(GSP DDIT3)的制备方法。根据本专利技术一个优选的实施方案，GSP DDIT3的制备步骤包括(I)克隆筛选通过NCBI Mapview数据库检索所有含有DDIT3(12ql3)基因断裂区两侧的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆。(2)克隆培养和鉴定按照筛选确定的克隆编号购买相应的克隆(InvitrogenRPCIlL C)，取100 μ I克隆菌液加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，37°C摇床中 摇菌培养8 12小时；针对DDIT3基因探针使用相应的STS引物进行PCR扩增，并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物片段进行分析，从而完成待选克隆的鉴定。(3)基因探针制备对鉴定阳性的菌液，进行质粒DNA的提取；通过OD值的测定对质粒DNA进行定量；然后，对质粒DNA进行荧光标记；对标记产物进行纯化；获得探针，避光、-20±5°C储存。(4)基因探针验证使用人类正常分裂中期淋巴细胞滴片进行探针验证。根据本专利技术一个优选的实施方案，克隆筛选步骤中含有DDIT3基因断裂点两端最优选的克隆，编号为 RPll_1077C21(chrl2 :57658810. . 57865820)和 CTD-2554015 (chrl2 57939268. · 58154978)。根据本专利技术一个优选的实施方案，RP11-1077C21克隆培养和鉴定步骤中使用的STS引物对序列为上游引物5’-CCACCTGGGCTGGACTCTAT-3’ (SEQ ID NO :1)和下游引物5’ -CCCACTTCCTAGGGTTGTTTTG-3’ (SEQ ID NO 2) ;PCR 扩增条件为94°C 5 分钟；(94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 45秒)X35循环；72°C 7分钟。CTD-2554015克隆培养和鉴定步骤中使用的 STS 引物对序列为上游引物 5’ -GGCAAACAGAGAAGAACCAGAAA-3’ (SEQ ID NO 3)和下游引物 5’ -ATGGGCTCAGGAAAGTAAAGACC-3’ (SEQ ID NO 4) ;PCR 扩增条件为94°C 5 分钟；(940C 30 秒，58 0C 30 秒，72 °C 45本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种辅助脂肪肉瘤鉴别诊断及治疗选择的DDIT3基因重排荧光原位杂交检测试剂盒，包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于荧光标记探针混合物包含GSP?DDIT3断裂探针，每人份荧光标记探针混合物中GSP?DDIT3探针的使用量为1.0μl。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，何瑰，陈华云，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：