一种卵巢透明细胞癌诊断试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种利用HNF1B荧光探针制备的荧光原位杂交检测试剂盒，还涉及HNF1B荧光探针的制备方法，本发明专利技术的HNF1B荧光探针及相应的试剂盒可用于卵巢透明细胞癌诊断和治疗方案选择。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用HNFlB荧光探针制备的荧光原位杂交检测试剂盒，还涉及HNFlB荧光探针的制备方法，本专利技术的HNFlB荧光探针及相应的试剂盒可用于卵巢透明细胞癌诊断和治疗方案选择。
技术介绍
卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖器官常见的肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。卵巢癌的病因尚不清楚，其发病可能与年龄、生育、血型、精神因素及环境等有关。卵巢癌临床早期无症状，鉴别其组织类型及良恶性相当困难，目前为止，临床资料统计 五年生存率仅25% 30%。卵巢癌是相对常见的病，大约有1. 4%的女性会患上这种病。发现早，90 %的病人都能活下来；发现迟，癌细胞扩散到卵巢，存活率低于30 %。卵巢透明细胞癌(Ovarian clear cell carcinoma, OCCA)占卵巢癌的5% 11 %,发病平均年龄58岁，与子宫内膜异位症的关系密切，在病变的卵巢中合并子宫内膜异位症达24%左右，而同时存在盆腔子宫内膜异位症病变的达25% 50%左右，这在其他卵巢上皮性癌中是少见的。卵巢透明细胞癌为恶性肿瘤，预后较其它分型更差，与临床分期有密切关系。卵巢癌检查有几种方法，包括细胞学诊断、超声波检查、免疫学检查等，但均不十分成功。目前而言，卵巢恶性肿瘤标志物的敏感性和特异性均不能满足早期诊断的需要，多用来检测治疗中和/或治疗后的病情变化，为评定疗效和及时发现肿瘤复发提供依据。肝细胞核因子-1 (HNFI homeobox B, HNF1B)位于17号染色体长臂I区2带，编码一种包含同源结构域的转录因子超家族成员，编码蛋白与DNA结合形成同源二聚体，或与 HNFla (hepatocyte nuclear factor1-alpha)结合形成异质二聚体。转录因子 HNFlB对胰腺细胞形成和维持血糖稳态具有重要作用。基因突变会导致肾囊肿和非胰岛素依赖型糖尿病或称为第二型糖尿病，在一些癌症中该基因的表达会发生改变。目前有研究表明，HNFlB是卵巢透明细胞癌的生物标志物，可有效区分透明细胞癌与其它病变类型。临床研究中通过RNA干扰该基因表达，能达到细胞凋亡目的，使该基因在治疗方面有广阔的应用前景。[Jin L, et al. Regulation of tissue-specific expression of renal organicanion transporters by hepatocyte nuclear factor I a /β and DNA methylation.JPharmacol Exp Ther, 2012Mar ;Stanislas Faguer, et al. Diagnosis, management, andprognosis ofHNFIB nephropathy in adulthood. Kidney International80,768-776 ;Berndt SI,Sampson J,Yeager M,et al. Large-scale fine mapping of the HNFlB locusand prostate cancer risk.Hum Mol Genet.201IAug 15 ；20 (16) :3322-9 ;Brimo F,Herawi M, Sharma R, et al. Hepatocyte nuclear factor-1β expression in clear celladenocarcinomas of the bladder and urethra diagnostic utility and implicationsfor histogenesis. Kim HJ, Bae JS, Lee J, et. al. HNFlBpolymorphism associatedwith development of prostate cancer in Korean patients. Hum Pathol. 201INov ；42(11) :1613-9. Urology. 201IOct ；78 (4) :969. el_6 ;Sohei Yamamoto，Hitoshi Tsuda，Shinsuke Aida, et, al.1mmunohistochemical detection of hepatocyte nuclearfactorIβ in ovarian and endometrial clear-cell adenocarcinomas and nonneoplasticendometrium. Human Pathology Vol. 38.1ssue 7，1074—1080 ；K. Yamaguchi，M. Mandai，T. Oura，N. Matsumura，J. Hamanishi and T. Baba et al.，Identification of an ovarianclear cell carcinoma gene signature that reflects inherent disease biology andthe carcinogenic processes, Oncogene 29(2010), pp.1741-1752.]目前试验室检测方法常见的有基于免疫组化的表达分析和基于荧光定量PCR方法(FQ-PCR)或测序技术的突变及缺失分析。 综上，HNFlB因其在卵巢透明细胞癌中的特异表达特征，有望作为肿瘤鉴别分型和靶向治疗的新靶标。但该基因的检测方法目前仅停留在试验室阶段，市场无灵敏度高、特异性好的检测试剂。荧光原位杂交技术基于碱基互补原则，用已知序列标记DNA探针与载玻片上的待测DNA/RNA互补杂交，在荧光显微镜下检测杂交信号判断结果。FISH技术将细胞遗传学和分子生物学改变联系起来，让微小的基因改变显现于肉眼之下，拓展了细胞遗传学检测的范围，显著提高了其识别异常染色体的能力。目前已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等检测。本专利技术利用荧光原位杂交技术，以HNFlB基因区段为靶标，设计并制备荧光探针。利用探针实现对HNFlB基因状态的检测，有助于卵巢透明细胞癌鉴别分型和治疗方案制定，从而达到早鉴别早治疗，提高诊疗效果。本专利技术提供了一种卵巢透明细胞癌分子标志物HNFlB探针的制备方法，并在此基础上利用探针自主研制了 HNFlB基因检测试剂盒，填补了国内该检测领域的空白，具有十分重大的意义。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供HNFlB基因探针(GSP HNF1B)和作为内控的用于17号染色体鉴别的17号染色体着丝粒探针(CSP17)的制备方法。根据本专利技术一个优选的实施方案，GSP HNFlB的制备步骤包括(I)克隆筛选通过NCBI Mapview数据库检索所有含有HNFlB (17ql2)基因的克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最优的克隆。(2)克隆培养和鉴定按照筛选确定的克隆编号购买相应的克隆，取100 μ I克隆菌液加入至500ml的TB培养液(氯霉素抗性)中，3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种辅助卵巢透明细胞癌诊断和治疗方案选择的HNF1B基因状态荧光原位杂交检测试剂盒，包括：1)杂交缓冲液、荧光标记探针混合物、未标记的竞争性DNA、DAPI复染剂，和2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其特征在于荧光标记探针混合物包含GSPHNF1B探针和17号染色体着丝粒探针，每人份荧光标记探针混合物中GSP?HNF1B和CSP17探针的使用量均为0.5μl。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，何瑰，陈华云，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：