本发明专利技术提供了一种检测鸡FMO3基因A1034T突变的引物和探针，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1~4所示。利用这些引物和探针，采用实时荧光定量PCR技术，能够快速灵敏地检测鸡FMO3基因A1034T突变位点即鱼腥味敏感基因的基因型，从而准确判定鸡只是否携带鱼腥味敏感基因位点。与传统的检测技术相比具有诸多优点，包括操作简单、检测速度快，只需要一次PCR反应即可判型，自动化程度高，高通量，灵敏度高，而且节约了时间，提高了检测效率。反应全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及用于检测鸡FM03基因A1034T突变的引物和特异性的TaqMan MGB探针以及检测方法和试剂盒。
技术介绍
2005年，Honkatukia等人研究发现，位于鸡8号染色体上的含黄素单氧化酶 (flavine containing monooxygenase 3,FM03)基因的一个错义突变是导致鱼渥味鸡蛋产生的原因。该突变位于FM03基因的第7外显子上，突变个体cDNA序列(GenBank登录号 AJ431390)的第1034位碱基腺嘌呤(A)被胸腺嘧啶(T)取代，这使得编码蛋白的第329位氨基酸由苏氨酸(T)转变为丝氨酸(S)，因此该突变又被命名为T329S突变。329位苏氨酸到丝氨酸的变异使含黄素单氧化酶的一个高度保守区域(FATGY)发生了改变，据推测，此区域可能是含黄素单氧化酶识别底物的结合区，这个区域的突变使含黄素单氧化酶不能识别体内的三甲胺，从而导致了三甲胺在鸡蛋中的沉积而产生了鱼腥味鸡蛋。此时，若饲料原料中含有鱼粉、油菜籽柏或过量的氯化胆碱时，则带有这种基因缺陷的蛋鸡体内的三甲胺 (TMA)不能正常代谢，三甲胺在鸡蛋中沉积，产生鱼腥臭味。三甲胺主要存在于蛋黄中，普通鸡蛋中三甲胺含量很低，约O.1 μ g/g，而在鱼腥味鸡蛋的蛋黄中平均高达1. O μ g/g，含量通常是正常鸡蛋的10倍以上(Hobson-Frobock等，1973)。三甲胺的沉积使得鸡蛋产生非常难闻的气味，严重降低了鸡蛋的品质和口感。此外三甲胺与亚硝酸盐作用可形成亚硝胺， 并有致癌作用，因此鱼腥味鸡蛋不仅影响食用且不利于人类健康。自Honkatukia等发现鸡的鱼腥味综合症与FM03基因的一个错义突变 有关后，许多研究人员和机构对该基因在不同品种鸡群中的频率与鸡蛋中三甲胺含量进行了大量研究。2006年，罗曼公司成为第一家成功剔除鱼腥味基因的育种公司，2008年开始，伊莎公司提供的商品代蛋鸡也不再含有任何对三甲胺敏感的鱼腥味基因。据张龙超(2006)研究结果显示在我国一些优良地方品种家禽中也含有频率较高的A1034T突变等位基因。初芹等(2010)和陈强等(2010)分别在北京油鸡和新杨绿壳蛋鸡中同时发现FM03基因除了 A1034T突变位点外，还存在另一个G895A多态位点，G895A突变同样位于FM03基因第7外显子上，使得编码氨基酸密码子由CCG变为CCA，但是不改变氨基酸类型，因而也不会影响FM03基因编码酶的功能。并且设计了引物，建立了更适合的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分子检测方法，通过使用限制性核酸内切酶Bsr I (BseNI)酶切PCR扩增产物，再进行琼脂糖凝胶电泳分型，根据条带数来区分鸡只 A1034T位点的基因型。随着人们对优质家禽产品消费需求的增加，许多地方品种鸡种，包括北京油鸡、绿壳蛋鸡等作为柴蛋鸡饲养，其规模和影响力日益增加。而且养殖方式也多元化，如大麦虫、 黄粉虫等养鸡模式，这些饲料中都可能含有三甲胺(TMA)或其前体物质。如果鸡群中含有 TT纯合基因型个体，即鱼腥味敏感个体，则所产鸡蛋很容易沉积三甲胺，出现鱼腥臭味，影响消费者食用和健康。虽然AT杂合基因型个体不直接产生鱼腥味鸡蛋，但是会将不利等位基因位点T位点传递给后代，导致后代出现TT纯合子。因此淘汰鱼腥味敏感基因位点T位点成为育种工作面临的重要任务之一。而建立一种快速、简便、准确，适合大规模、高通量的检测方法将会具有非常重要的意义。聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)方法是检测单碱基突变的常用方法之一，其原理是利用单碱基突变导致的酶切位点的产生或者消失。检测过程需要3 个步骤①根据酶切位点上下游序列设计引物，利用聚合酶链式反应扩增目的片段；②扩增产物的限制性内切酶消化酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测。显然，PCR-RFLP方法具有步骤繁琐，耗时长的缺点。DNA质量、扩增条件、内切酶消化条件、琼脂糖凝胶质量等都会影响到判型的有效性和准确性。非常不适合于大规模、高通量的检测。实时荧光定量TaqMan SNP分型技术是一种基于实时荧光定量PCR的单核苷酸多态性(SNP)检测方法，由美国ABI公司研发，基本原理是利用DNA聚合酶的核酸酶外切功能来水解探针，通过探针报告基团发出的荧光来检测PCR产物的基因型。等位基因分型需要两条探针(TaqMan探针)和一对引物，一条探针对应一种等位基因，每条探针在 5'和3'分别有一个含有荧光的报告基团和一个淬灭基团。当探针完整时，由于报告基团距离淬灭基团很近，报告基团的荧光能量被淬灭基团吸收。在PCR进行过程中，正反向引物在DNA聚合酶的引导下合成一个特定分子DNA，探针可以和目的DNA杂交，DNA聚合酶的 5' —3'核酸酶外切功能可以水解这个杂合分子，这样探针被水解后，5'报告基团和3' 淬灭基团被分开，5'报告基团发出荧光，根据检测到的荧光信号的颜色即可判定等位基因的基因型。PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，仪器每个PCR循环过程中收集一次荧光信号，随着PCR反应的进行荧光信号不断累积，根据荧光信号的种类及信号强度，判定SNP 基因型。TaqMan MGB探针是对传统TaqMan探针的改进，其优 点是3'端的淬灭基团是不发光的淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher, NFQ),因此当淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰；此外，TaqManMGB探针还具有更强的序列特异性， 实验结果更精确可靠等优点。总之，实时荧光定量TaqMan SNP分型技术与传统方法相比有诸多优点，包括检测速度快，灵敏度高，自动化程度高，而且经过一个PCR反应即可判型，反应全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有的采用PCR-RFLP方法检测该突变位点存在的步骤繁琐，耗时长，灵敏度低、检测结果易受实验条件影响等缺点，提供一种能够准确高效地检测 FM03基因A1034T突变位点的合适引物和特异性的TaqMan MGB探针，利用这些引物和探针， 采用实时荧光定量PCR技术，能够快速灵敏地检测待测鸡只FM03基因A1034T突变位点的基因型，从而准确筛查鸡只是否携带鱼腥味敏感基因位点。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种用于检测鸡FM03基因A1034T突变的引物， 所述引物包括上游引物FM03 F :5，-GTGCAGGACGACCTCGAT-3，(SEQ IDN0.1)下游引物FM03 R : 5 ’ -CTCCATGAAAGGAAAGGAGTGAGA-3 ’(SEQ ID NO. 2)。上游引物由18个碱基组成，对应GenBank中鸡FM03基因cDNA序列(登录号AJ431390)的第1001 1018位碱基；下游引物由24个碱基组成，对应鸡FM03基因cDNA序列的第1043 1066位碱基序列。该引物对的扩增片段长度为66bp。本专利技术还提供了与上述特异性引物配合使用的TaqMan荧光探针。进一步地，所述TaqMan荧光探针核苷酸序列为FM03-突变型等位基因探针5’ -ATCTTTGCCTCTGGTTAC (SEQ ID NO. 3)；FM03-野本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测鸡FMO3基因A1034T突变的特异性引物，其核苷酸序列为：上游引物FMO3F：5’?GTGCAGGACGACCTCGAT?3’；下游引物FMO3R：5’CTCCATGAAAGGAAAGGAGTGAGA?3。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：初芹，刘华贵，朱珊珊，张剑，王海宏，耿爱莲，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：
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