高选择性基因突变检测方法及其引物与引物设计方法技术

高选择性基因突变检测方法及其引物与引物设计方法，涉及基因突变的检测，提供高选择性基因突变检测方法，所述高选择性基因突变检测方法包括：根据目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物，用所述上游引物与下游引物进行PCR扩增并检测PCR扩增产物，从而获知目标基因突变位点。所述高选择性基因突变检测引物包括上游引物与下游引物，其中，所述上游引物包括标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补。本发明专利技术设计了高选择性基因突变检测引物，通过抑制野生型扩增，达到富集稀有突变产物的目的，从而实现对稀有突变的高效检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因突变的检测，特别涉及。
技术介绍
基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。目前市面上针对基因检测的方法有许多。但是在较高的野生型模板的背景下，针对较低含量的基因突变的检测能力有·限，因此针对基因稀有突变的检测还存在诸多的挑战。基因稀有突变，顾名思义指的是存在大于量野生基因序列背景中的极为稀少突变基因序列。在临床案例中，癌症初期或是治疗后病人血液中含有少量的肿瘤突变DNA ;孕妇外周血含有少量的胎儿DNA等，这些情况都属于稀有突变。许多引起肿瘤的体细胞突变都是掺杂在野生型细胞内的，所提的DNA也是带有大量野生型DNA，同样需要采用稀有突变的检测方法。因此，基因稀有突变检测在疾病防治医疗评价、无创产前筛查等具有十分重要的意义。目前稀有突变检测方法中，主要有作为“金标准”的基因测序。但是测序灵敏度有限，在大量野生型基因的背景下，测序仅能检测到含有20%的突变，会导致假阴性结果，而且耗时较长。相较于测序，变性高效液相色谱的灵敏度有所提高，但是需要PCR后处理，容易造成实验室污染，容易导致假阳性结果，特异性也有所限制，并且操作步骤繁杂，周期长。基于核酸杂交原理的检测方法，比如Taqman探针，其选择性检测水平与测序法相当。扩增阻碍突变系统(ARMS)是常用的稀有突变检测方法，基于引物3’末端碱基对不同错配碱基的分辨能力特异性选择扩增突变型模板，但由于分辨能力有限导致选择性一般且不同类型的突变差异性较大。2011年Life technology公司开发出一种高选择性突变检测技术一cast PCR技术，该技术基于ARMS技术，采用MGB探针的高特异性进一步提高了反应的选择性。但是MGB探针合成难度较大，费用较高，不利于广泛应用。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术的第一目的在于提供高选择性基因突变检测方法，所述高选择性基因突变检测方法可选择性扩增基因突变产物，通过抑制野生型扩增，达到富集稀有突变产物的目的，从而实现对稀有突变的高效检测。本专利技术的第二目的在于提供高选择性基因突变检测引物。本专利技术的第三目的在于提供高选择性基因突变检测引物设计方法。所述高选择性基因突变检测方法包括根据目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物，用所述上游引物与下游引物进行PCR扩增并检测PCR扩增产物，从而检测目标基因突变位点。所述上游引物包括标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补。所述上游引物更包括特异杂交序列，所述特异杂交序列与基因组模板序列互补杂交引导扩增，所述下游引物与基因组模板序列互补杂交引导扩增。所述上游引物至少分为两个区域，所述标签序列位于区域1，所述特异杂交序列位于区域2。所述PCR扩增可采用实时荧光PCR扩增并通过探针实时检测PCR扩增产物。所述高选择性基因突变检测引物包括上游引物与下游引物，其中，所述上游引物包括标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补。所述上游引物更包括一特异杂交序列，所述特异杂交序列与基因组模板序列互补杂交引导扩增，所述下游引物与基因组模板序列互补杂交引导扩增。所述上游引物至少分为 两个区域，所述标签序列位于区域1，所述特异杂交序列位于区域2。所述高选择性基因突变检测引物设计方法包括根据目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物，在上游引物设计标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补。所述上游引物更包括一特异杂交序列，所述特异杂交序列与基因组模板序列互补杂交引导扩增，所述下游引物与基因组模板序列互补杂交引导扩增。所述上游引物至少分为两个区域，所述标签序列位于区域1，所述特异杂交序列位于区域2。本专利技术设计了高选择性基因突变检测引物，通过抑制野生型扩增，达到富集稀有突变产物的目的，从而实现对稀有突变的高效检测。本专利技术中的高选择性基因突变检测方法具有高特异性，针对突变型模板设计的引物对可以耐受5000拷贝甚至更高拷贝数的野生型模板。同时，本专利技术可检测个位数拷贝的突变型模板，具有很高的灵敏度。本专利技术中检测方法选择性高，可有效检出突变含量为1/1000的模板。本专利技术成本低，仅需要一对引物即可实现选择性扩增。附图说明图I为本专利技术技术方案原理图。在图I中，1、2为区域I和区域2，分别为上游引物的标签序列与特异杂交序列所在区域，3为野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置，4、7为基因组模板序列,8为双链DNA,6为下游引物，I’为互补链3端序列,5为互补序列，GC为野生型基因位点，GA为突变的基因位点； 图2A为野生型模板梯度稀释检测结果图，在图2A中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，野生型模板梯度浓度分别为5000拷贝、500拷贝、50拷贝、5拷贝； 图2B为突变型模板梯度稀释检测结果图，在图2B中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，I、2、3、4分别为突变型模板梯度浓度分别为5000拷贝、500拷贝、50拷贝、5拷贝时的检测曲线； 图3为梯度稀释突变型模板与野生型模板掺入实验结果图。在图3中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，1、2、3、4分别为突变型与野生型比例分别为I: I、1:10、1:100、1:1000时的检测曲线；图4A为突变型模板梯度稀释检测结果图，在图4A中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，I、2、3、4分别为突变型模板梯度浓度分别为5000拷贝、500拷贝、50拷贝、5拷贝时的检测曲线； 图4B为野生型模板梯度稀释检测结果图，在图2B中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，野生型模板梯度浓度分别为5000拷贝、500拷贝、50拷贝、5拷贝； 图5为梯度稀释突变型模板与野生型模板掺入实验结果图。在图5中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，1、2、3、4分别为突变型与野生型比例分别为I: I、1:10、1:100、1:1000时的检测曲线。具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本专利技术的技术方案。 如图I所示，针对待检测的目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物。上游引物包括区域I和区域2，区域I为标签序列，与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置(简称为延伸产物序列)3反向互补，区域2为特异杂交序列，与基因组模板序列4互补杂交引导扩增，下游引物6与基因组模板序列7互补杂交引导扩增。基因组模板序列4基因组模板序列7均来自解链的双链DNA 8。上游引物在扩增的前两个循环无差别的扩增野生型模板及突变型模板，第三个循环开始，上游引物区域I的标签序列在退火阶段与其延伸产物序列3形成内部颈环结构，野生型模板中，其互补链3端序列I’与序列5完全互补杂交形成颈环结构，该3端以自身序列为模板延伸下去形成非常稳定的二级结构，该产物在之后的循环中不能被扩增，其中颈部(区域I)长度为6-18nt，形成二级结构的Tm值为60°C _75°C，环部长度为25_60nt ;突变型模板中，其互补链3端序列I’与序列5仍可杂交形成颈环，但3端第一个碱基与突变位点碱基不匹配(如图I中，GC突变本文档来自技高网...

【技术保护点】
高选择性基因突变检测方法，其特征在于，所述高选择性基因突变检测方法包括：根据目标基因突变位点设计相应的上游引物与下游引物，所述上游引物包括标签序列，所述标签序列与野生型模板的上游引物延伸序列中突变位点所在位置反向互补；用所述上游引物与下游引物进行PCR扩增并检测PCR扩增产物，从而检测目标基因突变位点。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王小波，
申请(专利权)人：厦门基科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：