一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法技术

本发明专利技术公开了一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其PCR反应体系中，引物浓度为0.32μM/μl，Taq酶浓度为0.2U/μl，dNTP浓度为0.4μM/μl，Mg2+的浓度为0.65μM/μl，DNA的浓度为2~4ng/μl。应用本发明专利技术所用的方法进行SSR分子标记PCR反应，所得到的条带清晰、多态性好、重复性高，而且操作简单，在菊属、亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属的野生种和品种间通用，应用前景十分广阔。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法。
技术介绍
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等优点，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。PCR五因素引物、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA模板和Mg2+。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成①模板DNA的变性模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2 4分钟，2 3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。SSR标记是一类重要的分子标记，应用于植物的育种、品种鉴定等领域，SSR标记的开发与利用需要一个灵敏度高，准确性好的PCR反应方法。而目前在菊属及其近缘种属(菊属、亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属)尚未研究出高效、通用性强的SSR标记的PCR反应方法。
技术实现思路
为填补在菊属、亚菊属，太行菊属、芙蓉菊属的野生种和品种之间没有通用的SSR标记PCR反应方法的空白，本专利技术的目的是提供一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法。本专利技术提供的菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其PCR反应体系如下引物浓度0.32 μ M/μ I Taq 晦浓度0.211/μΙ dNTP 浓度0.4 μ M/ μ I Mg2+的浓度0.65 μ M/μ I DNA样品的浓度2~4ng/ μ I 反应体系总体积为25 μ I,其中，所述引物可选自以下2对引物中的任意一对SSR标记LHJ-I弓丨物序列上游引物5’-ATGGTGGTGGTAGCTGGGT-3’(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物5’-GAGATCGGAGGGTGCGTG-3’(如 SEQ ID NO. 2 所示)SSR标记ΥΗ-2弓丨物序列上游引物5’-TTCGACGGGTGGTGGTGTT-3’(如 SEQ ID NO. 3 所示)下游引物5’-GACACCACAACGCTACCGC-3’(如 SEQ ID NO. 4 所示)其中，反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性 O. 5min，50_62°C复性 O. 5min，72°C延伸lmin, 30个循环；72°C延伸5min 。本专利技术还提供所述菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法在菊属、亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属的野生种和品种中的应用。本专利技术所提供的菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法具有如下优点I、本专利技术填补了在菊属，亚菊属，太行菊属，芙蓉菊属的野生种和品种之间缺少通用的SSR标记PCR反应方法的空白。2、本专利技术的SSR标记PCR反应方法灵敏度高，重复性好，易于操作，而且通用性好。3、有利于菊属，亚菊属，太行菊属，芙蓉菊属SSR标记的开发和利用，推动菊属及近缘种属的新品种培育和商品花卉生产。附图说明图I为本专利技术方法所做菊属品种和野生种的SSR标记PCR产物的琼脂糖电泳图。图2为本专利技术方法所做亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属及菊属野生种的SSR标记PCR产物的琼脂糖电泳图。其中，图I中PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带序号代表的种类依次是1野菊、2甘菊、3甘野菊、4毛华菊、5小红菊、6菊花脑、7紫花野菊、8神农香菊、9阳光小菊、10繁白露、11四季黄、12香玉、13上海小菊、14夏菊、15国庆红、16玉人面、17神马、18帅旗、19粉玉卷帘、20金葵台、21精兴将军。图2中PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带序号代表的种类依次是I亚菊、2矶菊、3灌木亚菊、4细裂亚菊、5异色亚菊、6柳叶亚菊、7太行菊、8长裂太行菊、9芙蓉菊、10甘野菊、11毛华菊。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中，菊属及近缘种属植物材料均取自北京林业大学种质资源圃，DNA样品的提取采用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取试剂盒完成，所用的Tag酶、dNTP和MgCl2是由Promega公司生产的，SSR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实施例I本专利技术菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法的建立(I)提取了菊属、亚菊属、太行菊属、芙蓉菊属内常用的野生种及其栽培品种的DNA样品。菊属野生种类有野菊，甘菊，甘野菊，毛华菊，小红菊，菊花脑，紫花野菊，神农香菊。菊属栽培种类中小菊品种有阳光小菊(盆栽小菊)，繁白露(北方地被小菊)，四季黄(北方地被小菊)，香玉(切花小菊)，上海小菊(南方地被小菊)，夏菊(夏季开花种类)，国庆红(南方地被小菊)，玉人面(茶用菊品种);菊属栽培种类中大菊有神马(重要切花菊品种)，帅旗(中国传统大菊品种)，粉玉卷帘(中国传统大菊品种)，金葵台(中国传统大菊品种)，精兴将军(日本大菊品种);亚菊属种类亚菊，矶菊(原产日本)，灌木亚菊，细裂亚菊，异色亚菊，柳叶亚菊；太行菊属太行菊，长裂太行菊(此属为中国特有，仅此两种);芙蓉菊属芙蓉菊(仅此一种，特产我国)。(2)经过大量的预实验，设计了 25 μ I体系PCR五因素4水平正交试验Taq 酶(5υ/μ I) :0. 25 μ 1,0. 5μ 1,0. 75 μ I, I. 0μ I ；dNTP (20 μ M/μ I) 0. 25 μ 1,0. 5μ 1,0. 75 μ I, I. 0μ I ；Mg2+ (6. 5 μ M/μ I ) I. 5 μ 1, 2. O μ 1, 2. 5 μ 1, 3. O μ I ；引物(ΙΟμΜ/L):0· 2μ 1，0· 4μ 1，0· 6μ 1，0· 8μ I ;DNA 样品(50ng/y I) :0. 5 μ 1，I. O μ 1，I. 5 μ 1，2· O μ I根据正交实验设计原理得到16个不同的反应体系，见表I。表IPCR反应体系1-1权利要求1.一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其特征在于，PCR反应体系如下引物浓度0.32 μ M/μ I Taq 酶浓度0.2υ/μ1dNTP 浓度0.4 μ M/μ IMg2+的浓度0.65 μ M/μ I DNA样品的浓度2 4ng/ μ I 反应体系总体积为25 μ I.2.如权利要求I所述的菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其特征在于，弓丨物为SSR标记LHJ-I引物序列 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种菊属及其近缘种属通用的SSR标记PCR反应方法，其特征在于，PCR反应体系如下：FDA00002156064500011.jpg

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张启翔，刘华，孙明，程堂仁，王佳，潘会堂，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：