本发明专利技术涉及一种新型连接酶反应介导的扩增方法及用途，通过三条连接探针的连接酶反应实现下游的通用扩增及检测。通过将检测标签序列、上游引物标签序列和下游引物结合标签序列分别填入三条不同的连接探针中达到消除非特异信号干扰的效果。其中含检测标签序列的探针杂交于目标序列时形成囊状结构且囊状结构两侧的特异杂交序列形成“杂交共同体”。三条连接探针杂交于目标序列相邻的位置上，在连接酶的作用下最终形成一条包含三个“标签”序列的完整探针链，连接产物最终由通用PCR系统实现扩增。本发明专利技术还包含三条连接探针的试剂盒和芯片，及其用途，特别是基因序列分型检测中的用途。该技术实现了降低反应背景、增强性噪比、避免假阳性的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种扩增方法，尤其涉及一种连接酶反应介导的扩增方法。
技术介绍
核酸检测技术已被广泛应用于分子遗传学、免疫学、肿瘤学及微生物学等方面的临床诊断。随着分子生物学的飞速发展，一些新的核酸检测方法也不断涌现，其中，连接酶依赖的检测技术就是其中的一类。连接酶是一种封闭DNA或RNA链上缺口(Nick)的酶，借助NAD+或ATP水解提供的能量催化2条核酸单链的3、端羟基和5、端磷酸基团反应形成磷酸二酯键。连接酶依赖的检测技术主要是通过核酸杂交原理及其在缺口连接处的保真性实现的。1988年，Landegren首先专利技术了连接酶体外突变检测技术0LA，并利用该技术鉴定了编码导致地中海镰刀型细胞贫血症的β球蛋白的突变等位基因0 s和野生型等位基因βΑ 之间的单碱基差异。1991年，Barany提取出耐热连接酶并发展了连接酶检测反应(Ligase detection reaction, LDR)禾口连接酶链式反应(Ligase chain reaction, LCR)技术。这两项技术的提出对连接酶依赖的体外检测技术的发展及应用具有深远的意义，但是都存在非特异信号干扰、易用性差等问题。其后，连接酶反应技术结合PCR技术，衍生出了一系列新的检测技术。如 LDR/PCR、MLPA、PLP (Padlock probe)、MIP (Molecular inversion probe) 等，这些技术主要通过连接酶反应实现目的基因的“特异转化”，再由PCR系统扩增转化后的特异产物实现检测。该类技术都表现出较高的检测通量，甚至能够实现>10000重的基因分型(MIP技术)，但是都存在非特异信号的干扰较严重，容易出现假阳性的问题。这类技术的非特异信号主要来源于1.非特异连接酶反应；2.非特异的PCR扩增。LDR/PCR、MLPA技术由于受到这两种非特异的影响，故检测的灵敏度有限，且非特异信号能被检测出，存在假阳性的风险。PLP及MIP技术采用了外切酶消化未连接杂交探针的方法，在一定程度上消除了杂交探针在PCR反应中的非特异扩增，但是当检测重数较高时，仍然会受到非特异连接的影响，假阳性的出现仍不可避免。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种克服连接酶反应及PCR的非特异信号干扰的扩增方法。该技术实现了降低反应背景、增强性噪比、避免假阳性等目的。为解决上述问题，本专利技术提供一种新型连接酶反应介导的扩增方法，通过三条连接探针的连接酶反应实现下游的通用扩增及检测，其特征在于每条连接探针由特异杂交序列及填入的标签序列组成，具体为目标序列7从3，端到5’端分别分为A段，B段，C段和D段，连接探针a为A段的反向互补序列2加上一段上游引物标签序列1组成，即2 — 1 ； 连接探针b为C段的反向互补序列3’，加上B段和C段之间的检测标签序列4和B段的反向互补序列3组成，即3’-4-3 ；连接探针c为一段下游引物结合标签序列6加上D段的反向互补序列5组成，即6 — 5 ；所述的序列1、4、6为不与目标序列杂交的序列。所述的上游引物标签序列1、下游引物结合标签序列6和检测标签序列4的设计原则分别为GC含量适中，Tm值为55-70°C，长度为18_3^p，与目标基因组无较高同源性。 此处的无较高同源性是指同源性低于50%。所述的序列2、3、3’、5为GC含量适中，Tm值为50_70°C，与目标序列特异杂交。所述的连接探针a、b和c的序列中除去序列1、4、6外均为特异杂交序列。。本专利技术还提供一个试剂盒，包含上述的连接探针a、b和c，及试剂盒的用途。本专利技术还提供一种芯片，包含上述的连接探针a、b和C，及芯片的用途。所述目标序列的A、B、C和D段相互之间无间隔。目标序列的GC含量适中，无重复序列或同源性较高的序列出现，连接探针特异杂交的位置最好不要有SNP或突变位点的出现，除非是SNP或突变检测实验中，SNP或突变位点最好位于连接探针的3’端。本专利技术还涉及一种连接酶反应介导的扩增方法用途。所述试剂盒、芯片和连接酶反应介导的扩增方法在进行基因序列分型、定量等检测中的用途。本专利技术检测的是已知目标序列，可检测突变位点、SNP位点、各物种目标基因(如细菌及病毒的目标DNA)的定性及定量反应等。本专利技术提供一种新型连接酶依赖的扩增方法——欧米伽探针技术(Omega probe technology)，该方法是在连接酶反应中，通过将检测标签序列、上游引物标签序列和下游引物结合标签序列分别填入三条不同的连接探针中达到消除非特异信号干扰的效果。中间连接探针形似“ Ω ”，我们形象地称之为欧米伽探针，所以称该方法为欧米伽探针技术。欧米伽探针技术的关键组成是三条连接探针，每条连接探针由特异杂交序列及填入的标签序列组成，三条连接探针的标签序列分别为连接探针a的上游引物标签序列、连接探针b的检测标签序列、连接探针c的下游引物结合标签序列(如图1)。本专利技术技术方案是通过三条连接探针杂交于目标序列相邻的位置上，其中，连接探针b杂交于目标基因序列时形成囊状结构(即为填入的检测标签序列4)，囊状结构两侧的特异杂交序列形成“杂交共同体”。三条连接探针在连接酶的作用下最终形成一条包含三个“标签”序列的完整探针链，该完整探针链即连接产物最终由通用PCR系统实现扩增。本专利技术的方法和步骤为基因组DNA模板经高温(98°C，5-10分钟)充分变性后，三条连接探针与待检基因位点DNA序列进行特异杂交(杂交于DNA序列上相邻的位置)，杂交后经耐热连接酶(如Ampligase (Epicentre)、Taq DNA ligase (NEB)等)连接反应，形成一条完整的连接探针。该步反应旨在将目标DNA转化为连接后的完整探针。第二步是用一对通用引物同时扩增这些已连接的完整探针，未连接的探针不能被正常扩增，会出现线性扩增(右侧连接探针出现线性扩增)或非特异扩增(左侧或右侧探针与引物非特异结合扩增出非特异产物)，而引导检测反应的欧米伽探针两端无引物标签序列和引物结合标签序列， 不会出现非特异扩增，体系中检测不到非特异信号，故无非特异信号的干扰。上游引物标签序列和下游引物结合标签序列来源于通用引物序列。本专利技术一个实施例中的上游通用引物F是序列TGGAGCGACGATACGAAGATA (SEQ ID NO 11)；下游通用弓| 物 R 是序列GCTCCAAGATCCTATCTAGA (SEQ ID NO: 12)。本专利技术是一种新型的连接酶反应介导的扩增方法，不同于传统的依赖连接反应的扩增方法(如LDR/PCR、MLPA、PLP及MIP等)，该技术具有如下优点1.针对一个待检测的基因序列设计三条连接探针，保证检测反应极高的特异性。尤其适用于同源性较高序列的分辨检测；2.消除非特异连接信号的干扰本技术中的非特异连接产物在PCR中要么是线性扩增、要么存在少量的指数扩增，而这些产物均不会被检测出；3.避免非特异扩增信号的干扰连接探针b不会出现非特异性扩增，而连接探针a和 c与PCR引物间的少量非特异扩增则不会被检测出；4.三条连接探针中均加入标签序列，可在相同的扩增体系和检测体系下实现不同目标序列的高效扩增和检测；5.实验流程及操作时间短，检测系统开放，可通过实时PCR系统、芯片系统等实现检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王小波，
申请(专利权)人：厦门基科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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