单标记通用探针与特异性引物的组合物及其DNA检测方法技术

本发明专利技术公开了单标记通用探针与特异性引物的组合物及其DNA检测方法，所述单标记通用探针包括第一探针和第二探针，所述特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物和下游引物均包括接头序列、标签序列和特异性序列，上游引物与下游引物的接头序列相同；所述第一探针包含第一通用序列和第一修饰基团，第二探针包含第二通用序列和第二修饰基团，第一修饰基团和第二修饰基团能配合发出荧光信号；所述第一通用序列与第一标签序列互补或反向互补，第二通用序列与第二标签序列相同或反向。本发明专利技术提供的组合物及检测方法，具备PCR实时分析检测和熔点分析能力，在检测容量上进一步提升，具有较强的检测通用性。

Composition of Single Labeled Universal Probe and Specific Primer and Its DNA Detection Method

The invention discloses a composition of a single-labelled universal probe and a specific primer and a DNA detection method thereof. The single-labelled universal probe comprises a first probe and a second probe, and the specific primer comprises upstream and downstream primers. The upstream and downstream primers include a joint sequence, a label sequence and a specific sequence, and the joint sequence phase of the upstream and downstream primers. The first probe contains the first universal sequence and the first modified group, the second probe contains the second universal sequence and the second modified group, the first modified group and the second modified group can cooperate to emit fluorescent signals; the first universal sequence complements or reverse complements the first tag sequence, and the second universal sequence is the same or reverse with the second tag sequence. The composition and detection method provided by the invention have the real-time analysis and melting point analysis capabilities of PCR, further improving the detection capacity, and strong detection versatility.

【技术实现步骤摘要】
单标记通用探针与特异性引物的组合物及其DNA检测方法
本专利技术涉及实时荧光PCR检测
，尤其涉及一种单标记通用探针与特异性引物的组合物及其DNA检测方法。
技术介绍
在诸多实时荧光PCR检测技术中，以TaqMan探针技术应用最为广泛，该探针主要基于DNA聚合酶的水解活性来引发探针上的荧光基团和淬灭基团不可逆的分离，进而形成荧光信号的累积。该技术虽然具有较高的检测效率，但是该技术仅能用于DNA/RNA分子实时分析定量，缺乏PCR后熔点分析的能力。因此，TaqMan探针技术应用过程中始终存在检测容量低的问题。分子信标探针技术实质上是改良的TaqMan探针技术，即一种空间上呈“发夹”结构的TaqMan探针技术。探针中“发夹”结构的存在使得该技术能够应用于PCR后熔点分析。进一步来说，该技术一定程度上解决了PCR的检测容量的问题，但在检测效率和灵敏度不足使得其在实时分析中的应用受限。相似的，双杂交探针由两条相邻的标记不同荧光基团的探针所组成，主要利用荧光基团间的荧光能量共振转移现象(FRET)来实现荧光信号的检出，该技术同时具备了分子信标探针PCR后熔点分析以及Taqman探针实时定量分析方面的优点。公开号为CN102321765A的中国专利技术专利申请，公开了一种新的荧光PCR检测技术，该技术利用单标记探针同时具有引物和检测探针的特性，巧妙借助空间上的“茎环”结构实现荧光信号的可逆淬灭，同时具备了上述三种技术的优点，并且增加了形成“倒置”扩增曲线的反应特性，丰富了分析DNA/RNA分子的检测维度。然而，以上四种实时荧光PCR检测技术均存在一个共同缺点，即需要针对特定的DNA/RNA分子设计特定探针，进一步来说，缺乏检测通用性，使得检测过程更加复杂，增加检测成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种兼备上述四种技术的优点的新型检测工具和检测技术，即具备PCR实时分析检测和熔点分析能力，并能够在检测容量上进一步提升，同时克服现有的实时荧光PCR检测技术缺乏“检测通用性”的缺点的技术。为实现上述目的，本专利技术的第一方面提供了一种基于单标记通用探针与特异性引物的组合物的DNA检测方法，所述方法采用一组单标记通用探针和一组特异性引物构建PCR反应体系；所述单标记通用探针包括第一探针和第二探针，所述特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物包括接头序列、第一标签序列和第一特异性序列，下游引物包括接头序列、第二标签序列和第二特异性序列，上游引物与下游引物的接头序列相同；所述第一特异性序列、第二特异性序列分别与靶标基因反义链、正义链的一段特异性序列反向互补；所述第一探针包含第一通用序列，其一端标记有第一修饰基团，第二探针包含第二通用序列，其一端标记有第二修饰基团，所述第一修饰基团和第二修饰基团能配合发出荧光信号；所述第一通用序列与第一标签序列互补或反向互补，第二通用序列与第二标签序列相同或反向。说明性地参照图1，图1中示出了单标记通用探针和特异性引物的结构示意图，其中第一探针1包括第一通用序列2和第一修饰基团3，第二探针4包括第二通用序列5和第二修饰基团6。上游引物7包括接头序列8、第一标签序列9和第一特异性序列10，下游引物11包括接头序列12、第二标签序列13和第二特异性序列14。示例性的，在图1中，第一通用序列2与第一标签序列9反向互补，第一修饰基团3标记于第一探针1的3′端；第二通用序列5与第二标签序列13相同，第二修饰基团6标记于第二探针4的5′端。运用以上的探针和引物构建反应体系，参照图2a-2d，其以待测靶标基因的正义链15为示例，示出了其进行PCR扩增反应前三轮的扩增原理示意图。相应的，待测靶标基因的反义链的扩增情况可以参照该正义链的扩增情况。在图2a中示出了一轮扩增反应的情况，待测靶标基因变性解链为正义链15后，其上的特异性序列16与下游引物11的第二特异性序列14反向互补，在后续的退火和延伸过程中，下游引物11与正义链15结合，并沿其自身5′-3′的方向延伸，形成一轮扩增的PCR产物的单链17，其相当于下游引物11与对应的反义链的组合。接下来参照图2b，其示出了二轮扩增反应的情况，单链17由于具有反义链上的特异性序列(位于其3′端，未标示)，其与上游引物7的第一特异性序列10反向互补，因而在退火和延伸过程中，上游引物7与单链17结合，并沿其自身5′-3′的方向延伸，形成二轮扩增的PCR产物的单链18，其相当于上游引物7、正义链15、下游引物11的反向互补序列的组合，此时，请参照图2c。最后，在三轮扩增反应中，参照图2d，二轮扩增的PCR产物经变性后解为单链18，在单链18中，由于接头序列12经过前二轮扩增后，形成为原始序列的反向互补序列12′，因而在退火时，与接头序列12序列相同的接头序列8与该反向互补序列12′更倾向于相互杂交，使得单链18自身形成一茎环结构体19。此外，单链18上具有与对应下游引物11的第二标签序列13的反向互补序列13′，且第二探针4的第二通用序列5与第二标签序列13相同，即第二探针4的第二通用序列5与该反向互补序列13′反向互补，而第一探针1的第一通用序列2本身就与单链18上所具有的第一标签序列9反向互补，这样在退火过程中，第一探针1和第二探针4由原来的游离状态演变为与茎环结构体19结合，使得第一修饰基团3和第二修饰基团6靠近。在这里，第一探针1和第二探针4应当是过量的，以保证有足够的单标记通用探针与该茎环结构体19结合。图示实施例的第一修饰基团和第二修饰基团可为荧光基团和淬灭基团，如此一来，当单标记通用探针处于游离状态时，淬灭基团无法对荧光基团进行淬灭，整个PCR混合液中存在较高荧光信号本底。随着第一探针1和第二探针4与茎环结构体19结合，第一修饰基团和第二修饰基团靠近，荧光基团被淬灭基团所淬灭，随着PCR循环数的增加，茎环结构体19不断积累，PCR混合液荧光信号本底随循环次数增加而下降，最终呈现倒置的扩增曲线。在下述提及到的可能替代的实施方式中，第一修饰基团和第二修饰基团为受体荧光基团或者供体荧光基团，则出现相反的荧光情况。随着第一探针1和第二探针4与茎环结构体19结合，第一修饰基团和第二修饰基团靠近，其中的供体荧光基团的发射谱与受体荧光基团的激发谱具有一定程度的重叠，当供体荧光基团被激发时，受体荧光基团会因供体荧光基团激发能的转移而被激发，表现为供体荧光基团产生的荧光强度较其单独存在时要低的多，而受体荧光基团发射的荧光信号却大大增强。因而，随着PCR循环数的增加，茎环结构体19不断积累，PCR混合液荧光信号本底随循环次数增加而上升，最终呈现正置的扩增曲线。因而，从上述说明可以得到，本专利技术的图示实施例(1)探针只需要单标记，且设计的探针序列为通用序列，其与特异性引物的对应部分相同或互补，在设计探针序列时省时省力，节约成本；(2)只有当PCR产物形成正确的二级茎环结构，且探针特异性杂交时才能出现信号差，特异性高，选择性好；(3)可用于熔解分析，可对检测靶序列定性分析；(4)可灵活使用各种荧光原理不同的修饰基团，从而形成“倒置”及“正置”的扩增曲线。在某一可能的实施方式中：所述接头序列、第一标签序列、第二标签序列为任意的不与靶标基因杂交的附加核酸序列，从而避免不必本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于单标记通用探针与特异性引物的组合物的DNA检测方法，其特征在于：所述方法采用一组单标记通用探针和一组特异性引物构建PCR反应体系；所述单标记通用探针包括第一探针和第二探针，所述特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物包括接头序列、第一标签序列和第一特异性序列，下游引物包括接头序列、第二标签序列和第二特异性序列，上游引物与下游引物的接头序列相同；所述第一特异性序列、第二特异性序列分别与靶标基因反义链、正义链的一段特异性序列反向互补；所述第一探针包含第一通用序列，其一端标记有第一修饰基团，第二探针包含第二通用序列，其一端标记有第二修饰基团，所述第一修饰基团和第二修饰基团能配合发出荧光信号；所述第一通用序列与第一标签序列互补或反向互补，第二通用序列与第二标签序列相同或反向。

【技术特征摘要】
1.基于单标记通用探针与特异性引物的组合物的DNA检测方法，其特征在于：所述方法采用一组单标记通用探针和一组特异性引物构建PCR反应体系；所述单标记通用探针包括第一探针和第二探针，所述特异性引物包括上游引物和下游引物；所述上游引物包括接头序列、第一标签序列和第一特异性序列，下游引物包括接头序列、第二标签序列和第二特异性序列，上游引物与下游引物的接头序列相同；所述第一特异性序列、第二特异性序列分别与靶标基因反义链、正义链的一段特异性序列反向互补；所述第一探针包含第一通用序列，其一端标记有第一修饰基团，第二探针包含第二通用序列，其一端标记有第二修饰基团，所述第一修饰基团和第二修饰基团能配合发出荧光信号；所述第一通用序列与第一标签序列互补或反向互补，第二通用序列与第二标签序列相同或反向。2.如权利要求1所述的DNA检测方法，其特征在于：所述接头序列、第一标签序列、第二标签序列为任意的不与靶标基因杂交的附加核酸序列。3.如权利要求2所述的DNA检测方法，其特征在于：当所述第一通用序列与第一标签序列互补，所述第一修饰基团标记于第一探针的5′端；当所述第一通用序列与第一标签序列反向互补，所述第一修饰基团标记于第一探针的3′端。4.如权利要求2所述的DNA检测方法，其特征在于：当所述第二通用序列与第二标签序列相同，所述第二修饰基团标记于第二探针的5′端；当所述第二通用序列与第二标签序列反向，所述第二修饰基团标记于第二探针的3′端。5.如权利要求2所述的DNA检测方法，其特征在于：所述第一修饰基团和第...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈月琴，刘旭宏，王小波，钟鸿，戴丽丽，王秀云，
申请(专利权)人：厦门基科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35