一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法。具体地，本发明专利技术的方法可同时获得目标靶点和非目标靶点的扩增子，通过对扩增子建库和高通量测序可获得多个sgRNA靶点和脱靶位点的基因组切割效率，同时还能获知其Indel突变序列特征，从而快速、简便、全面而准确地评估sgRNA的活性和特异性。

A Method for Detecting the Activity and Specificity of sgRNA by Amplifier High-throughput Sequencing

The invention provides a method for detecting the activity and specificity of sgRNA by amplifier high throughput sequencing technology. Specifically, the method of the present invention can simultaneously obtain amplifiers of target and non-target targets. By constructing amplifier libraries and high-throughput sequencing, the efficiency of genome cleavage of multiple sgRNA targets and miss sites can be obtained. At the same time, the characteristics of the Indel mutation sequence can be obtained, so that the activity and specificity of sgRNA can be evaluated quickly, simply, comprehensively and accurately.

【技术实现步骤摘要】
一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法。
技术介绍
随着多种农业动物，如猪，牛和鸡等的全基因组测序完成，海量基因组信息可供基因功能和分子育种研究。基因功能研究方法有多种，如RNAi技术，转基因和基因敲除技术等。CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点编辑技术是第三代基因组编辑技术。CRISPR(成簇的规律间隔短回文重复序列，clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPRRNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA，阻止病毒感染。研究人员通过结合单分子成像和大量的生化试验，证实Cas9的基因组编辑能力是通过称作为“PAM”(protospaceradjacentmotif)的短DNA序列来实现的。Cas9只有在识别PAM后才利用RNA–DNA碱基配对来切割靶DNA。CRISPR/Cas9技术可实现多种基因组定点修饰，如基因敲除/敲入、单碱基突变、基因修复、条件性基因敲除和激活基因表达等。相比于传统基因修饰技术，它具有许多无可比拟的优点。首先，CRISPR/Cas9系统操作简单，核心作用元件为Cas9蛋白，只需设计靶向特定基因的sgRNA，即可修饰目标基因；其次，该系统在全基因组上可用的靶向结合位点很多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可用的CRISPR/Cas9编辑位点，可以说这一技术能对任一基因进行操作；再次，CRISPR/Cas9系统更具有可拓展性，例如可突变或修饰Cas9蛋白，使其不切断DNA双链，而只切开单链。利用paired-gRNA，可大大减低脱靶风险。此外，还可将Cas9蛋白上融合功能元件，激活目标基因表达。最重要的是，CRISPR/Cas9技术可同时实现敲除多个基因，可在大部分动、植物体内进行基因组编辑，而且实验时间周期相对较短，实验费用低廉。尽管CRISPR/Cas9技术存在一定的脱靶风险，但其实验操作简单，无物种限制，特别是对农业大动物开展功能基因组学研究提供了强有力的工具。目前传统检测sgRNA活性的方法是T7EN1酶切法和克隆测序法，但该方法检测灵敏低，单次实验检测位点数量有限，相对检测成本较高。因此，本领域迫切需要开发一种基于扩增子高通量测序技术评估sgRNA活性和特异性的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于扩增子高通量测序技术评估sgRNA活性和特异性的方法，该方法主要将sgRNA靶点序列提取方法、扩增子高通量测序和数据分析方法进行有机结合，通过实验优化建立一种一步法评估多个sgRNA打靶和脱靶位点的新方法。本专利技术第一方面提供了一种利用扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和/或特异性的方法，所述方法包括步骤：(i)提供一待测样本，所述样本为基因组DNA样品，所述基因组DNA样品来自经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织；(ii)对所述待测样本进行PCR扩增和纯化，获得扩增序列；(iii)在T4多聚核苷酸激酶存在下，修复所述扩增序列的平末端；(iv)对步骤(iii)所述的扩增序列，用接头序列进行接头连接；(v)补平对步骤(iv)所述的扩增序列的末端；(vi)对步骤(v)获得的扩增序列进行IndexingPCR；(vii)用高通量测序仪进行测序；以及(viii)分析所述的测序数据，从而获得检测结果，所述检测结果包括：sgRNA的活性和/或脱靶位点切割效率。在另一优选例中，在步骤(ii)中，还包括浓缩步骤，获得含有所述扩增序列的扩增产物浓缩物。在另一优选例中，所述扩增产物浓缩物中，所述扩增产物的浓度为5-50ng/μL，较佳地，8-45ng/μL，更佳地，10-40ng/μL，更佳地，10-30ng/μL。在另一优选例中，所述基因组编辑技术包括CRISPR/Cas9。在另一优选例中，所述经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织选自下组：(a)在多种sgRNA引导下，进行基因编辑所获得的细胞或组织；(b)用多种sgRNA同时对多个靶点进行基因编辑所获得的细胞或组织；(c)用一种sgRNA对多个个体进行基因编辑所获得的细胞或组织；(d)用一种sgRNA对一个靶点进行基因编辑所获得的细胞或组织。在另一优选例中，所述经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织是在N种sgRNA引导下进行基因编辑的细胞或组织，其中，N为1-20，较佳地1-10，更佳地2-5。在另一优选例中，所述方法还包括：在步骤(viii)中，进一步地获得经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织中的Indel突变序列特征。在另一优选例中，所述的细胞或组织来自以下物种：人、非人哺乳动物、家禽、植物。在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、兔)、牛、猪、羊、马、狗、猫、非人灵长动物(如猴)。在另一优选例中，所述的细胞包括：体细胞、干细胞、生殖细胞、非分裂细胞、或其组合。在另一优选例中，所述的细胞包括：肾细胞、上皮细胞、内皮细胞、或其组合。在另一优选例中，所述的样本选自下组：血液、血浆、体液、尿液、皮肤、毛发、组织、或其组合。在另一优选例中，所述的组织选自下组：耳朵、尾、粘膜组织、或其组合。在另一优选例中，所述的PCR扩增包括针对靶位点(ontarget)的PCR扩增和针对脱靶位点(offtarget)的PCR扩增。在另一优选例中，所述步骤(ii)中，所述扩增序列包括含有靶位点(ontargetsite)和脱靶位点(offtargetsite)的扩增序列。在另一优选例中，所述的靶位点选自下组：基因的编码区、基因的非编码区(3'-UTR、启动子区域、5'-UTR区)、内含子区、或其组合。在另一优选例中，所述的基因包括结构基因、调控基因、或其组合。在另一优选例中，所述的基因包括蛋白编码基因、lincRNA基因、miRNA基因、或其组合。在另一优选例中，所述的靶位点选自下组：DMD基因、ANPEP基因、hnRNPK基因、TP53基因、miR-21基因、CRYGC基因、MSTN基因、或其组合。在另一优选例中，所述扩增序列包括一个或多个(较佳地，1-1000个，更佳地，1-100个)含有靶位点(ontargetsite)和脱靶位点(offtargetsite)的扩增序列。在另一优选例中，所述待测样本还包括基因组未编辑的细胞或组织。在另一优选例中，所述基因组未编辑的细胞或组织作为对照样本。在另一优选例中，所述步骤(viii)中，还包括步骤：将所述待测样本与所述对照样本进行比对，从而获得sgRNA的活性和/或特异性的步骤。在另一优选例中，所述对照样本含有待测样本中相同的未编辑的基因组DNA样品。在另一优选例中，所述sgRNA的特征序列具有式I结构：NmNGG(I)式中，N代表A、T、C、G中任一种碱基；m为17、18、19、20或21。在另一优选例中，m为20。在另一优选例中，所述的sg本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和/或特异性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(i)提供一待测样本，所述样本为基因组DNA样品，所述基因组DNA样品来自经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织；(ii)对所述待测样本进行PCR扩增和纯化，获得扩增序列；(iii)在T4多聚核苷酸激酶存在下，修复所述扩增序列的平末端；(iv)对步骤(iii)所述的扩增序列，用接头序列进行接头连接；(v)补平对步骤(iv)所述的扩增序列的末端；(vi)对步骤(v)获得的扩增序列进行Indexing PCR；(vii)用高通量测序仪进行测序；以及(viii)分析所述的测序数据，从而获得检测结果，所述检测结果包括：sgRNA的活性和/或脱靶位点切割效率。

【技术特征摘要】
1.一种利用扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和/或特异性的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(i)提供一待测样本，所述样本为基因组DNA样品，所述基因组DNA样品来自经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织；(ii)对所述待测样本进行PCR扩增和纯化，获得扩增序列；(iii)在T4多聚核苷酸激酶存在下，修复所述扩增序列的平末端；(iv)对步骤(iii)所述的扩增序列，用接头序列进行接头连接；(v)补平对步骤(iv)所述的扩增序列的末端；(vi)对步骤(v)获得的扩增序列进行IndexingPCR；(vii)用高通量测序仪进行测序；以及(viii)分析所述的测序数据，从而获得检测结果，所述检测结果包括：sgRNA的活性和/或脱靶位点切割效率。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(ii)中，还包括浓缩步骤，获得含有所述扩增序列的扩增产物浓缩物。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织是在N种sgRNA引导下进行基因编辑的细胞或组织，其中，N为1-20，较佳地1-10，更佳地2-5。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤(viii)中，进一步地获得经基因组编辑技术编辑过的细胞或组织中的Indel突变序列特征。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞或组织来自以下物种：人、非人哺乳动物、家禽、植物。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样本选自下组：血液、血浆、体液、尿液、...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵书红，谢胜松，韩晓松，赵长志，苗义良，李新云，倪攀，刘向东，李长春，徐学文，马云龙，高杨，陈毅龙，杨高娟，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42