一种单细胞测序筛选成纤维细胞标记分子的方法技术

本发明专利技术公开了一种单细胞测序筛选成纤维细胞标记分子的方法，包括以下步骤：（1）提取肿瘤成纤维细胞；（2）分离单细胞并进行裂解；（3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA；（4）以cDNA为模板进行PCR扩增，产物纯化，进行Tagmentation反应，完成cDNA测序文库构建；（5）对构建的cDNA文库进行高通量测序；（6）测序结果进行生物信息学分析，寻找肿瘤成纤维细胞特异性的标记分子。

A Single Cell Sequencing Method for Screening Fibroblast Marker Molecules

The invention discloses a single cell sequencing method for screening fibroblast marker molecules, including the following steps: (1) extracting tumor fibroblasts; (2) isolating and splitting a single cell; (3) reverse transcription of the sample's RNA to obtain a cDNA; (4) PCR amplification using a DNA as a template, product purification, Tagmentation reaction, and completion of the construction of a DNA sequencing library; (5) High throughput sequencing of the constructed cDNA library; (6) Bioinformatics analysis of the sequencing results to find specific markers for tumor fibroblasts.

【技术实现步骤摘要】
一种单细胞测序筛选成纤维细胞标记分子的方法
本专利技术属于生物医学领域，尤其是涉及一种利用单细胞测序筛选肿瘤成纤维细胞标记分子的方法。
技术介绍
肿瘤相关成纤维细胞（CAF）是肿瘤间质中最主要的细胞成分，在肿瘤的发生和发展过程中扮演着至关重要的角色。CAF可以募集内皮祖细胞到肿瘤局部促进肿瘤新生血管的生成和肿瘤的生长。这些肿瘤相关成纤维细胞除了表达vimentin这一成纤维细胞的标记物外，还特异性表达FAP、-SMA，但不表达CK、desmin，在形态、功能、蛋白质表达、对细胞因子的反应性及遗传学水平上，它与正常成纤维细胞（NF）存在明显差异。肿瘤相关成纤维细胞目前是研究热点之一，很多机制尚存在争议，但是普遍认为该细胞与肿瘤的发生发展和转移侵袭有着密不可分的关系。肿瘤相关成纤维细胞能分泌趋化因子12（CXCL12）和肝细胞生长因子（HGF），前者能直接刺激肿瘤细胞进行增殖和转移，后者导致细胞外基质（ECM）的改变，进而造成体内上皮细胞增殖和发生恶性转化。除此之外，CXCL12和HGF与肿瘤分泌的血管内皮生长因子（VEGF）一起影响肿瘤新生血管的生成。以此方式，肿瘤相关成纤维细胞能同时影响正常上皮细胞和肿瘤细胞的旁泌性因子来影响肿瘤的发生发展，越来越多的证据表明肿瘤基质中成纤维细胞的突变往往发生在癌症发展之前。以肿瘤相关成纤维细胞为靶点的药物是提高肿瘤治愈率的一种新方法。正是这种固有差异为新药物的设计和治疗策略的高度选择性提供了多种独特的靶点。我们利用单细胞测序技术在肿瘤成纤维细胞的单细胞水平上对全转录组进行扩增与测序，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律，最后利用生物信息学分析技术，从mRNA水平上分析寻找肿瘤成纤维细胞的特异性标记分子，为肿瘤的靶向治疗提供新的靶点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述存在的科学问题，提供一种利用单细胞测序筛选肿瘤成纤维细胞标记分子的方法。本专利技术的技术方案概述如下：本专利技术的单细胞测序筛选肿瘤成纤维细胞标记分子的方法，包括以下步骤：1）提取肿瘤成纤维细胞；2）分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液；3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国ThermoFisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对上述步骤2）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA；4）以cDNA为模板进行PCR扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国Illumina公司的NexteraXT试剂盒，按照说明书对上述步骤3）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；5）对测序结果进行生物信息学分析，从mRNA水平上分析寻找肿瘤成纤维细胞的特异性标记分子。优选的，以上所述步骤1）中，将从肿瘤组织中提取的成纤维细胞进行单细胞测序，利用生物信息学分析从mRNA水平上寻找其特异的标记分子。本专利技术的具有突出的实质性特点和显著的进步：通过利用单细胞测序技术，为肿瘤靶向治疗寻找新的靶点提供更为全面、客观、准确的方法，为肿瘤靶向治疗寻找新的靶点提供一种新的思路和方法。附图说明图1为从荷瘤小鼠剥离得到的肿瘤组织。图2为剪碎的肿瘤组织。图3为肿瘤相关成纤维细胞显微镜下的细胞形态。图4为利用本专利技术提取方法得到的肿瘤相关成纤维细胞的FAP表达率。图5为利用本专利技术提取方法得到的肿瘤相关成纤维细胞的免疫细胞化学染色的实验结果。具体实施方式下面对本专利技术的实施操作做详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施案例。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的说明。1.应用自创的提取方法获得高质量的肿瘤成纤维细胞。2.准备肿瘤成纤维细胞单细胞样品。分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液。3.对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国ThermoFisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对步骤3）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA。4.以cDNA为模板进行扩增，构建测序文库，进行测序，使用美国Illumina公司的NexteraXT试剂盒，按照说明书对步骤4）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序。5.通过生物信息学分析寻找肿瘤成纤维细胞特异性的标记分子。实施例1本实施例选择小鼠（Musmusculus）HepG2移植瘤模型为实验材料，对其肿瘤成纤维细胞进行了单细胞转录组的测序。一.肿瘤相关成纤维细胞的提取步骤S1）：取3只4-5周龄BALB/c裸鼠，每只于右侧腋下皮下接种人肝癌HepG2细胞，待肿瘤平均体积长至约1.0×1.0×1.0cm3时，得到荷瘤小鼠。将荷瘤小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%（体积百分比浓度）的乙醇水溶液中3-5min，得到消毒后的小鼠；在超净工作台内，用无菌剪刀和无菌镊子从消毒后的小鼠胸口剪开小鼠皮肤，小心剥离得到肿瘤组织。参看附图1，图为从荷瘤小鼠剥离得到的肿瘤组织。用眼科剪稍微剪碎肿瘤组织（此时的肿瘤组织大小为0.5×0.5×0.5cm3），并在0.01mol/LPBS中浸泡（使肿瘤组织完全浸润在0.01mol/LPBS中）2min后将其取出，得到浸泡后的肿瘤组织。用眼科剪在无菌平皿上充分剪碎浸泡后的肿瘤组织（此时的肿瘤组织大小为0.2×0.2×0.2mm3），在剪碎浸泡后的肿瘤组织的过程中适时滴加0.01mol/LPBS，保持该肿瘤组织处于湿润状态，得到剪碎的肿瘤组织。附图2为用眼科剪充分剪碎肿瘤组织得到的剪碎的肿瘤组织。向上述盛有剪碎的肿瘤组织的无菌平皿中滴加胶原酶Ⅰ溶液，用剪过头的1mL枪头吹散肿瘤组织，得到胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物。上述方法中，所述眼科剪又称眼科手术剪、眼用手术剪，是剪切眼部软组织用的器械。所述眼科剪可为头端宽0.4毫米，尖而不锐的眼科剪；所述眼科剪也可为头端宽1.6毫米的眼科剪。步骤：把胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物转移到50mL离心管中，然后将所述离心管进行如下C1）和C2）的处理，C1）和C2）交替进行3次：C1）将盛有胶原酶Ⅰ-肿瘤组织混合物的50mL离心管在震荡器上进行震荡3min，得到震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物；C2）将震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物在37℃水浴锅中孵育2min，得到胶原酶消化后的肿瘤组织A。将步骤C2）的胶原酶消化后的肿瘤组织A进行离心处理：c1）将孵育后的胶原酶消化后的肿瘤组织于300g下离心6min，弃上清液；c2）向步骤c1）的沉淀中加入20mL0.01mol/LPBS，混匀后于300g下离心6min，弃上清液；c3）向步骤c2）的沉淀中加入20mL0.01mol/LPBS，混匀后于300g下离心6min，弃上清液，得到胶原酶消化后的肿瘤组织。将上述胶原酶消化后的肿瘤组织铺在培养瓶中，加入DMEM完全培养基，在细胞培养箱中培养两天，细胞培养箱中CO2的体积百分比为6-8%，温度为35-38℃，得到组织结构松散的肿瘤组织。步骤S3）：再在结构松散的肿瘤组织中加入胶原酶溶液进行消化，并重复步骤S2），得到经交替消化、培养后的组织结构松散的肿瘤组织。步骤S4）：向组织结构松本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单细胞测序筛选成纤维细胞标记分子的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）提取肿瘤成纤维细胞；2）分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液；3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国ThermoFisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对上述步骤2）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA；4）以cDNA为模板进行PCR扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国Illumina公司的NexteraXT试剂盒，对上述步骤3）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；5）对测序结果进行生物信息学分析，寻找肿瘤成纤维细胞特异性的标记分子。

【技术特征摘要】
1.一种单细胞测序筛选成纤维细胞标记分子的方法，其特征在于：包括以下步骤：1）提取肿瘤成纤维细胞；2）分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液；3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国ThermoFisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对上述步骤2）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA；4）以cDNA为模板进行PCR扩增，构建测序文库，进...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永祥，薛志刚，钟莉娉，阳诺，何坚，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45