一种肿瘤ctDNA的信息统计方法技术

本发明专利技术提供一种肿瘤ctDNA的信息统计方法，涉及一种临床辅助检测技术领域。该发明专利技术包含以下步骤：提取血浆中的ctDNA、DNA的测序、序列对比与统计、QPCR检测、拷贝数变异检测和片段差异统计。本发明专利技术收样方便、简洁，可作为一种非侵入性，可重复性和高敏感性的液体活检技术。

An Information Statistical Method for Tumor CTDNA

The invention provides an information statistic method of tumor ctDNA, which relates to the technical field of clinical auxiliary detection. The invention comprises the following steps: extracting ctDNA from plasma, DNA sequencing, sequence comparison and statistics, QPCR detection, copy number variation detection and fragment difference statistics. The method has the advantages of convenient and concise sampling, and can be used as a non-invasive, repeatable and highly sensitive liquid biopsy technique.

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤ctDNA的信息统计方法
本专利技术涉及一种临床辅助检测
，特别是涉及一种肿瘤ctDNA的信息统计方法。
技术介绍
肿瘤是严重危害人类生命健康的一类慢性疾病，随着肿瘤分子生物学的发展，临床上已达到对肿瘤进行基因水平上的诊断及靶向治疗。目前，实体瘤的遗传图谱是从手术或活检组织标本中取得。但是，组织活检标本不能反映其异质性，且由于获取标本采用侵入性手段，给患者带来一定痛苦。因此，寻找可以替代肿瘤组织活检标本并具有高度敏感性和特异性的肿瘤标志物具有十分重要的意义。近年来不断有报道，血游离DNA在健康人的血液中含量极低，但当机体处于特殊疾病状态(如肿瘤、炎症疾病和组织创伤等)时，其含量明显上升，且在肿瘤患者中游离DNA还存在DNA完整性、微卫星变化、基因突变、DNA超甲基化及染色体基因重排等肿瘤特异性的改变，同时由于检测血液样本具有容易获取、快速简便且无创伤等优点，因此，检测肿瘤患者血中游离DNA可视为一种“液体活检”。2015年，MITTechnologyReview杂志将“液体活检技术”评为2015年度十大突破技术之一，有力证明了液体活检技术具有强大的发展潜力和前景。血游离DNA、循环肿瘤DNA(ctDNA)的来源及生物学特点血游离DNA又名循环DNA，是指血循环中具有DNA双螺旋结构的核苷酸片段，分子量0.5～3kb。在血液中，其一部分以游离形式存在，另一部分通过与蛋白质结合成复合物或附着在细胞表面。现临床上使用石蜡包埋的组织切片获取肿瘤相关基因信息，但随着对肿瘤分析日益增多，组织活检样本出现了很大的局限性，如很多患者无法进行手术取样，某些肿瘤解剖位置不便进行穿刺，穿刺本身带来的临床危险及反复取材带给患者巨大痛苦等。因此，ctD-NA的标本采集要求与检测手段不断受到研究者的重视。
技术实现思路
针对上述问题中存在的不足之处，本专利技术提供一种肿瘤ctDNA的信息统计方法，使其收样方便、简洁，可作为一种非侵入性，可重复性和高敏感性的液体活检技术。为了解决上述问题，本专利技术提供一种肿瘤ctDNA的信息统计方法，其特征在于，包括以下步骤：S10、提取血浆中的ctDNA；S20、DNA的测序：将上述提取出的游离DNA，分别构建样本文库，其中100-500bp的DNA分子两端被加上测序所用接头，来自不同样本的游离DNA被加上不同的标签序列，从而在一次测序中得到的数据中可以使多个不同样本的数据区分开，然后对样本文库进行测序；S30、序列对比与统计：将上述测序后得到的不同样本的游离DNA的序列与标准人类基因组的序列进行对比，得到上述游离DNA片段长度信息及定位于人类基因组相应位置得信息，将标准人类基因组划分多个区域，统计每个区域中所含有的上述游离DNA的序列的个数ni，j和平均GC含量GCi，j，其中i和j分别表示区域编号和样本编号；S40、QPCR检测：以提取的ctDNA为模板，利用设计好的肿瘤易感基因SNP突变为点分子探针，对ctNDA中的肿瘤易感基因进行检测；S50、拷贝数变异检测：以每条染色体的长短臂为统计单元，加和计算每个样本中各条染色体长短臂上总拷贝率之和，计算出每条染色体臂在对照样本中的值来判断该染色体臂是否发生了数目异常；S60、片段差异统计：根据S30计算所得的片段长度信息，分别统计140-200bp的主峰位置，及其所占所有序列的比例，通过这两个值计算反映出待检测样本在正常人群中的利群程度。优选的，所述S10血浆中ctDNA的提取包括以下步骤：S101、EDTA抗凝管中抽取5ml静脉血，上下颠倒混匀，4℃运输；S102、静脉血放入离心机，1600g，4℃，离心10min，吸取上清液至新的无菌2.0ml离心管中，16000g，4℃，离心10min，在吸取上清液至新的无菌2.0ml离心管中；S103、向2mlEP管中加入1ml血浆样本，在加入1mllysisbuffer，30ul蛋白酶K和60ul纳米颗粒吸附磁珠，充分颠倒混匀5min，将混匀样品放入离心机，12000rpm，常温离心3min，吸弃上清；S104、向含有沉淀的管中加入1mlwashbufferI，用移液枪反复吹打，将沉淀充分悬浮均匀，放入离心机，常温离心，13000rpm，1min，吸弃上清；S105、向含有沉淀的管中加入1mlwashbufferII，用移液枪反复吹打，将沉淀充分悬浮均匀，放入离心机，常温离心，13000rpm，1min，吸弃上清；S106、离心管开盖状态下，于56℃水浴中加热3min，以挥发掉未能吸尽的washbufferII，加入50-70ulEB缓冲液，充分悬浮管底的bead沉淀，盖紧管盖，于56℃水浴15min，取出离心管于14000rpm离心3min，所得上清即为DNA溶液，用移液枪将其移入新管；S107、DNA置于-20℃保存备用。优选的，所述S50中，基因拷贝数计算方法如下：收集正常非肿瘤患者50例，分别提取ctDNA，并进行QPCR检测，检测结果得到的CT值作为Y值带入到模板制备获得的计算公式y＝kx+b中，得到X值，10x即为模板上样量2ulctDNA中所含的改基因拷贝数，利用新公式(10x*a)/2b计算出每毫升血浆中该基因拷贝数，其中a为ctDNA总体积，b为QPCR上样模板体积。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：收样方便、简洁，可作为一种非侵入性，可重复性和高敏感性的液体活检技术，可应用于各种肿瘤易感基因及癌症，是一种先于临床肿瘤标志物检测的重要癌症治疗效果，耐药性及复发风险评估手段。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合实例对本专利技术作进一步详细说明，但所举实例不作为对本专利技术的限定。本专利技术的实施例一种肿瘤ctDNA的信息统计方法，其中，包括以下步骤：S10、提取血浆中的ctDNA；S20、DNA的测序：将上述提取出的游离DNA，分别构建样本文库，其中100-500bp的DNA分子两端被加上测序所用接头，来自不同样本的游离DNA被加上不同的标签序列，从而在一次测序中得到的数据中可以使多个不同样本的数据区分开，然后对样本文库进行测序；S30、序列对比与统计：将上述测序后得到的不同样本的游离DNA的序列与标准人类基因组的序列进行对比，得到上述游离DNA片段长度信息及定位于人类基因组相应位置得信息，将标准人类基因组划分多个区域，统计每个区域中所含有的上述游离DNA的序列的个数ni，j和平均GC含量GCi，j，其中i和j分别表示区域编号和样本编号；S40、QPCR检测：以提取的ctDNA为模板，利用设计好的肿瘤易感基因SNP突变为点分子探针，对ctNDA中的肿瘤易感基因进行检测；S50、拷贝数变异检测：以每条染色体的长短臂为统计单元，加和计算每个样本中各条染色体长短臂上总拷贝率之和，计算出每条染色体臂在对照样本中的值来判断该染色体臂是否发生了数目异常；S60、片段差异统计：根据S30计算所得的片段长度信息，分别统计140-200bp的主峰位置，及其所占所有序列的比例，通过这两个值计算反映出待检测样本在正常人群中的利群程度。S10血浆中ctDNA的提取包括以下步骤：S101、EDTA抗凝管中抽取5ml静脉血，上下颠倒混匀，4℃运输；S102、静脉血放入离心机，16本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肿瘤ctDNA的信息统计方法，其特征在于，包括以下步骤：S10、提取血浆中的ctDNA；S20、DNA的测序：将上述提取出的游离DNA，分别构建样本文库，其中100‑500bp的DNA分子两端被加上测序所用接头，来自不同样本的游离DNA被加上不同的标签序列，从而在一次测序中得到的数据中可以使多个不同样本的数据区分开，然后对样本文库进行测序；S30、序列对比与统计：将上述测序后得到的不同样本的游离DNA的序列与标准人类基因组的序列进行对比，得到上述游离DNA片段长度信息及定位于人类基因组相应位置得信息，将标准人类基因组划分多个区域，统计每个区域中所含有的上述游离DNA的序列的个数ni，j和平均GC含量GCi，j，其中i和j分别表示区域编号和样本编号；S40、QPCR检测：以提取的ctDNA为模板，利用设计好的肿瘤易感基因SNP突变为点分子探针，对ctNDA中的肿瘤易感基因进行检测；S50、拷贝数变异检测：以每条染色体的长短臂为统计单元，加和计算每个样本中各条染色体长短臂上总拷贝率之和，计算出每条染色体臂在对照样本中的值来判断该染色体臂是否发生了数目异常；S60、片段差异统计：根据S30计算所得的片段长度信息，分别统计140‑200bp的主峰位置，及其所占所有序列的比例，通过这两个值计算反映出待检测样本在正常人群中的利群程度。...

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤ctDNA的信息统计方法，其特征在于，包括以下步骤：S10、提取血浆中的ctDNA；S20、DNA的测序：将上述提取出的游离DNA，分别构建样本文库，其中100-500bp的DNA分子两端被加上测序所用接头，来自不同样本的游离DNA被加上不同的标签序列，从而在一次测序中得到的数据中可以使多个不同样本的数据区分开，然后对样本文库进行测序；S30、序列对比与统计：将上述测序后得到的不同样本的游离DNA的序列与标准人类基因组的序列进行对比，得到上述游离DNA片段长度信息及定位于人类基因组相应位置得信息，将标准人类基因组划分多个区域，统计每个区域中所含有的上述游离DNA的序列的个数ni，j和平均GC含量GCi，j，其中i和j分别表示区域编号和样本编号；S40、QPCR检测：以提取的ctDNA为模板，利用设计好的肿瘤易感基因SNP突变为点分子探针，对ctNDA中的肿瘤易感基因进行检测；S50、拷贝数变异检测：以每条染色体的长短臂为统计单元，加和计算每个样本中各条染色体长短臂上总拷贝率之和，计算出每条染色体臂在对照样本中的值来判断该染色体臂是否发生了数目异常；S60、片段差异统计：根据S30计算所得的片段长度信息，分别统计140-200bp的主峰位置，及其所占所有序列的比例，通过这两个值计算反映出待检测样本在正常人群中的利群程度。2.一种如权利要求1所述的一种肿瘤ctDNA的信息统计方法，其特征在于，所述S10血浆中ctDNA的提取包括以下步骤：S101、EDTA抗凝管中抽取5ml静脉血，上下颠倒混匀，4℃运输；S102、静脉血放入离心机，1600g，4℃，离心10min，吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：隋长江，
申请(专利权)人：沈阳精准医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21