使用增强的核苷酸特异性三元复合物形成检测的核酸测序方法和系统技术方案

提供用于检测核苷酸特异性三元复合物的形成的方法和系统，所述核苷酸特异性三元复合物包含DNA聚合酶、核酸和与所述引发的模板核酸的模板化碱基互补的核苷酸。所述方法和系统促进下一正确核苷酸的确定，而无需将所述核苷酸以化学方式掺入所述引物中。这有利地提高信噪比并且增加可在边结合边测序方案中获得的结果的质量，并且使得能够实现延伸的读段长。这些结果甚至可在使用未标记、原生核苷酸的程序中实现。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用增强的核苷酸特异性三元复合物形成检测的核酸测序方法和系统相关申请本申请要求2016年4月22日提交的美国临时申请号62/326,356的权益。这一在先申请的完整公开内容由此以引用的方式整体并入。
本专利技术一般来说涉及生物
更具体说来，本专利技术涉及核酸测序技术。背景模板核酸链的精确序列测定在基因组分析、分子诊断学等中有多种重要应用。甚至在已知位置处来自替代物的单核苷酸碱基的鉴别也可用作分析单核苷酸多态性(即，“SNP”)的基础。已知的核酸序列的短区段的检测已经用于从临床或环境来源鉴别细菌、真菌和病毒病原体。在已知的核酸序列中检测遗传或获得性基因变体(例如，改变或突变)也提供重要的信息，例如与对某些药物的改变的易感性有关的信息。最后，基因组规模的测序取决于可组装至一个或多个邻接序列中的数百万个核苷酸的正确鉴别。这些情况中的每一者均显著地取决于在沿着模板核酸链的不同位置处一次一种单个核苷酸的正确鉴别。人类基因组计划完全地通过使用常规荧光桑格双脱氧核糖核苷酸测序技术来实现。从那时起，后续技术已经简化了用于获得多核苷酸序列信息的程序，所述程序旨在将基因组分析整合至常规临床和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定测试核苷酸是否是下一正确核苷酸的方法，所述下一正确核苷酸包含与引发的模板核酸中的引物紧邻下游的模板链中的下一碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：(a)使所述引发的模板核酸与包含DNA聚合酶的第一反应混合物接触；(b)使来自步骤(a)的所述引发的模板核酸与包含所述DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第二反应混合物接触；(c)分别在步骤(a)和(b)中的每一者期间的一个或多个时刻测量所述引发的模板核酸与所述第一和第二反应混合物的DNA聚合酶的结合，但所述测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中；和(d)使用来自步骤(c)的所测量结合结果来确定所述测试核苷酸是否是所述下一正确核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.22 US 62/326,3561.一种确定测试核苷酸是否是下一正确核苷酸的方法，所述下一正确核苷酸包含与引发的模板核酸中的引物紧邻下游的模板链中的下一碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：(a)使所述引发的模板核酸与包含DNA聚合酶的第一反应混合物接触；(b)使来自步骤(a)的所述引发的模板核酸与包含所述DNA聚合酶和所述测试核苷酸的第二反应混合物接触；(c)分别在步骤(a)和(b)中的每一者期间的一个或多个时刻测量所述引发的模板核酸与所述第一和第二反应混合物的DNA聚合酶的结合，但所述测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中；和(d)使用来自步骤(c)的所测量结合结果来确定所述测试核苷酸是否是所述下一正确核苷酸。2.如权利要求1所述的方法，其中所述测试核苷酸是不包含任何所添加的荧光标记的原生核苷酸，并且其中步骤(c)不包括测量来自构象敏感染料的荧光或吸收信号的差异，所述构象敏感染料由于所述DNA聚合酶结合至所述测试核苷酸而改变光学特性。3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反应混合物不包含所述测试核苷酸。4.如权利要求3所述的方法，其进一步包括步骤(e)，即通过形成磷酸二酯键而将所述测试核苷酸以化学方式掺入所述引发的模板核酸的引物中。5.如权利要求4所述的方法，其进一步包括重复步骤(a)-(e)。6.如权利要求5所述的方法，其中步骤(a)-(e)重复至少50次。7.如权利要求4所述的方法，其进一步包括步骤(f)，即使用第二测试核苷酸替代所述测试核苷酸来重复步骤(a)-(e)，其中所述测试核苷酸和所述第二测试核苷酸彼此不同。8.如权利要求3所述的方法，其进一步包括步骤(e)，即用第三反应混合物替代所述第二反应混合物，所述第三反应混合物包含含可逆终止子部分的可逆终止子核苷酸和不同于所述第二反应混合物的DNA聚合酶的DNA聚合酶。9.如权利要求8所述的方法，其进一步包括步骤(f)，即通过形成磷酸二酯键将所述可逆终止子核苷酸掺入所述引物中。10.如权利要求9所述的方法，其进一步包括步骤(g)，即从掺入所述引物中的所述可逆终止子核苷酸去除所述可逆终止子部分。11.如权利要求10所述的方法，其进一步包括重复步骤(a)-(g)至少50次。12.如权利要求3所述的方法，其中所述引发的模板核酸固定至固体支撑物，并且其中步骤(b)包括从含有所述第一反应混合物的容器移动所述固体支撑物至含有所述第二反应混合物的不同容器。13.如权利要求3所述的方法，其中所述引发的模板核酸固定至固体支撑物，并且其中步骤(a)和(b)中的每一者均包括使反应混合物流经所述引发的模板核酸。14.如权利要求3所述的方法，其中步骤(c)包括在步骤(a)和(b)中的每一者期间连续地测量所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合。15.如权利要求3所述的方法，其中步骤(c)包括测量指示所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合的光学信号，和接着计算所测量的光学信号之间的差异以确定由步骤(b)得到的经测量的结合是否超过由步骤(a)得到的经测量的结合。16.如权利要求3所述的方法，其中步骤(c)包括测量指示所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合的光学信号，和接着计算所测量的光学信号的比率以确定由步骤(b)得到的经测量的结合是否超过由步骤(a)得到的经测量的结合。17.如权利要求3所述的方法，其中步骤(c)包括测量指示所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合的光学信号，和接着计算所测量的光学信号的时间依赖性改变速率以确定由步骤(b)得到的经测量的结合是否超过由步骤(a)得到的经测量的结合。18.如权利要求3所述的方法，其中所述测试核苷酸是选自由dATP、dGTP、dCTP、dTTP和dUTP组成的组的原生核苷酸。19.如权利要求3所述的方法，其中所述测试核苷酸不包含外源荧光标记。20.如权利要求3所述的方法，其中所述测试核苷酸是不包含外源标记的未标记的测试核苷酸。21.如权利要求3所述的方法，其中所述测试核苷酸是核苷酸类似物。22.如权利要求21所述的方法，其中所述核苷酸类似物包含可逆终止子部分。23.如权利要求22所述的方法，其中所述包含所述可逆终止子部分的核苷酸类似物进一步包含荧光标记。24.如权利要求3所述的方法，其中所述引发的模板核酸固定至表面，并且其中步骤(c)包括测量折射率的改变以测量所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合。25.如权利要求24所述的方法，其中步骤(c)包括通过干涉术或表面等离子体共振传感测量折射率的改变。26.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反应混合物的DNA聚合酶不含所添加的荧光标记。27.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反应混合物的DNA聚合酶不含所添加的荧光标记，所述荧光标记在所述DNA聚合酶结合至核苷酸之后改变特性。28.如权利要求20所述的方法，其中所述第一反应混合物的DNA聚合酶不含所添加的荧光标记，所述荧光标记在所述DNA聚合酶结合至核苷酸之后改变特性。29.如权利要求28所述的方法，其中所述引发的模板核酸固定至表面，并且其中步骤(c)包括测量折射率的改变以测量所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合。30.如权利要求1所述的方法，其中所述第一反应混合物进一步包含浓度低于当所述测试核苷酸为所述下一正确核苷酸时实现最大三元复合物形成所需的浓度的所述测试核苷酸，并且其中所述第二反应混合物包含浓度足以在所述测试核苷酸为所述下一正确核苷酸时实现最大三元复合物形成的所述测试核苷酸。31.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)包括如果由步骤(b)得到的经测量的结合超过由步骤(a)得到的经测量的结合，那么确定所述测试核苷酸是所述下一正确核苷酸。32.一种鉴别下一正确核苷酸的方法，所述下一正确核苷酸包含与引发的模板核酸中的引物紧邻下游的模板链中的下一碱基互补的碱基，所述方法包括以下步骤：(a)使所述引发的模板核酸与包含DNA聚合酶的第一反应混合物接触；(b)使来自步骤(a)的所述引发的模板核酸与包含所述DNA聚合酶和第一测试核苷酸的第二反应混合物接触；(c)使来自步骤(b)的所述引发的模板核酸与包含所述DNA聚合酶、所述第一测试核苷酸和第二测试核苷酸的第三反应混合物接触；(d)使来自步骤(c)的所述引发的模板核酸与包含所述DNA聚合酶、所述第一测试核苷酸、所述第二测试核苷酸和第三测试核苷酸的第四反应混合物接触；(e)使来自步骤(d)的所述引发的模板核酸与包含所述DNA聚合酶、所述第一测试核苷酸、所述第二测试核苷酸、所述第三测试核苷酸和第四测试核苷酸的第五反应混合物接触；(f)在步骤(a)-(e)中的每一者期间的一个或多个时刻测量所述引发的模板核酸与所述DNA聚合酶的结合，所述第一测试核苷酸并未以化学方式掺入所述引物中；(g)鉴别所述下一正确核苷酸：(i)如果由步骤(b)得到的经测量的结合超过由步骤(a)得到的经测量的结合，那么是所述第一测试核苷酸，或(i...

【专利技术属性】
技术研发人员：科里·M·丹巴赫，
申请(专利权)人：欧姆尼欧美公司，
类型：发明
国别省市：美国,US