一种监测核酸文库复杂程度的方法技术

本文提供一种监测核酸文库复杂程度的方法。本文提供一种确定或监测核酸文库复杂程度的方法，所述方法包括以下步骤：1)以文库中的核酸为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线，2)当曲线达到平台期后，将扩增曲线对扩增循环数求导，导数值越小，指示库容越大。本文还提供包括所述确定或监测核酸文库复杂程度方法的改进的SELEX方法，以及通过所述改进的SELEX方法获得核酸适配体的方法。本发明专利技术的方法可以是自动化方法。本发明专利技术的方法简单易于判定，可以通过仪器直接获得明确的结果。

A method for monitoring the complexity of nucleic acid libraries

This paper provides a method for monitoring the complexity of nucleic acid libraries. This paper provides a method to determine or monitor the complexity of nucleic acid libraries. The method includes the following steps: 1) PCR amplification using nucleic acid as template in libraries to obtain the amplification curve; 2) When the curve reaches the plateau stage, the amplification cycle number is derived from the amplification curve. The smaller the derivative, the larger the library capacity is indicated. This paper also provides an improved SELEX method including the method described for determining or monitoring the complexity of nucleic acid libraries, and a method for obtaining nucleic acid aptamers by the improved SELEX method. The method of the present invention may be an automation method. The method of the present invention is simple and easy to determine, and the clear result can be obtained directly by the instrument.

【技术实现步骤摘要】
一种监测核酸文库复杂程度的方法
本专利技术涉及生物学领域和化学领域，特别涉及分子生物学领域。具体的，涉及一种复杂核酸文库如SELEX筛选中的核酸文库的复杂程度监测方法。
技术介绍
核酸文库复杂程度的监测目前还缺乏很好的手段，已经报导的一些方法主要是针对SELEX(SystematicEvolutionofLigandbyExponentialEnrichment，即配体指数级富集系统进化)筛选过程中文库的复杂程度的分析判断。SELEX技术是20世纪90年代初发展起来的一种新的组合化学技术，是一个在人工体外合成的大容量随机寡核苷酸序列文库中，通过PCR扩增技术，指数级富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过若干轮筛选，从而获得高亲和力和特异性的核酸适配体(aptamer)。目前核酸适配体筛选的难点之一在于缺乏有效的筛选进程监测手段，因筛选通常要很多轮，每一轮常涉及很多步骤，整个实验周期长。如果仅仅依靠多轮筛选后获得的文库检测亲和力来判断筛选成败，这存在很多缺陷。一是不知道失败发生在哪一轮，更无从知晓失败的真正原因；二是当筛选多轮之后，如果没有明显的亲和力，也无法判断是因为还没有筛选到足够的轮数，还是已经失败，无法给出是该停止筛选还是需要继续筛选的明确指导。三是检测亲和力常常需要用特定的方法，若每一轮都检测会浪费大量的时间、精力和科研资源。已经报导的SELEX过程的文库复杂程度监测手段除了测序外，还可以根据序列多态性(RFLP)、荧光定量PCR实验中的Tm值，dHPLC等方法。其中利用文库序列多态性的方法，涉及酶解以及电泳等系列过程，操作繁琐且不够灵敏，通过Tm值来监测筛选进程，受PCR体系影响较大，结果不稳定，即便条件控制严格，差值也很小，甚至与误差相近。为提升可靠性，2013年出现了改良的方法(reMELTing)，效果依然不理想。参考文献T.Schutzeetal.，AcalibrateddiversityassayfornucleicacidlibrariesusingDiStRO--aDiversityStandardofRandomOligonucleotides.NucleicAcidsRes38，e23(Mar1，2010).R.Beier，E.Boschke，D.Labudde，NewstrategiesforevaluationandanalysisofSELEXexperiments.BioMedresearchinternational2014，849743(2014).J.Vanbrabant，K.Leirs，K.Vanschoenbeek，J.Lammertyn，L.Michiels，reMeltingcurveanalysisasatoolforenrichmentmonitoringintheSELEXprocess.Analyst139，589(Feb7，2014).D.Airdetal.，AnalyzingandminimizingPCRamplificationbiasinIlluminasequencinglibraries.Genomebiology12，(2011).N.Mencinetal.，MonitoringtheprogressofselectionduringSELEX.CurrentOpinioninBiotechnology24，S110(Jul，2013).J.Vanbrabant，K.Leirs，K.Vanschoenbeek，J.Lammertyn，L.Michiels，reMeltingcurveanalysisasatoolforenrichmentmonitoringintheSELEXprocess.Analyst139，589(Dec23，2013).
技术实现思路
本专利技术建立了根据荧光定量PCR扩增曲线来判断文库复杂程度的方法，可以很好的克服现有方法的缺点。根据本专利技术可以检测SELEX实验中任意一轮筛选有效性，不仅可以看到每一轮文库的复杂程度，也可以比较几个文库之间的复杂程度差异，方便的应用到筛选的进程监测中。本专利技术的原理：SELEX筛选时扩增的模板为复杂模板而并非单一模板，当PCR扩增曲线达到平台期之后，变性完退火时可能会出现两条链并不能完全互补配对的情况，即只有引物区配对，中间随机区域无法配对，此时PCR产物能结合的染料数量相比完全配对时有所减少，故会出现荧光值下降的趋势。随着筛选的进行，文库的复杂程度降低，富集程度增加，PCR产物的两条链分开之后再次完全配对的概率增加，因此扩增曲线平台期的荧光值会表现出由最开始几轮的降低而变为平缓或者上升。即扩增曲线在达到平台期之后的曲线，横坐标任一循环数对应的点求导计算斜率比上一轮的数值大，说明文库的复杂程度降低，有富集，该轮筛选有效。如果扩增曲线在平台期已经变得很平缓或者上升，即斜率的数值大于或者等于0，提示该轮的文库的库容已经很小了，可以选择停止筛选并将该轮文库检测亲和力，若仍旧没有亲和力，则预示着筛选失败，可尽早寻找其它的解决方法，避免投入更多的时间和精力以及耗材。本专利技术的方法简单易读，仪器直接给出结果，不会模棱两可。经过后期的亲和力检测，以及高通量测序验证，证实该方法简单可靠。在一些实施方案中，本专利技术提供一种确定或监测核酸文库复杂程度的方法，所述方法包括以下步骤：1)以文库中的核酸为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线，2)当曲线达到平台期后，将扩增曲线对扩增循环数求导，导数值越小，指示库容越大。在一些实施方案中，本专利技术的方法可以确定或监测RNA文库的复杂程度。例如，当对RNA文库进行分析时，所述方法还可以包括将RNA文库反转录成cDNA文库，以反转录成的cDNA文库为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线。在一些实施方案中，本专利技术方法中的核酸模板是复杂模板，优选的所述核酸文库的复杂程度是变化的。例如，随着筛选的进行，文库的复杂程度降低。在一些实施方案中，随着文库的复杂程度降低，富集程度增加，扩增曲线则会表现出由最开始几轮的在达到平台期之后会降低而变为达到平台期之后变平缓或者上升。在一些实施方案中，扩增曲线纵坐标达到平台期之后的曲线，对于横坐标任一循环数对应的点求导计算斜率比上一轮的数值大，指示文库的复杂程度降低，有富集，由此指示该轮筛选有效。在一些实施方案中，如果扩增曲线在达到平台期后已经变得很平缓或者上升，即对于扩增曲线达到平台期之后的曲线，斜率的数值大于或者等于0，指示该轮的文库的库容已经很小了，由此指示可以选择停止筛选。在一些实施方案中，对于扩增曲线纵坐标达到平台期之后的曲线，斜率的数值大于或者等于0，指示该轮的文库的库容小，由此可以将该轮文库检测亲和力；在一些实施方案中，此时若仍旧没有亲和力，则指示筛选失败。如本领域技术人员所知，在PCR扩增曲线中，横坐标和纵坐标可以分别表示循环数和荧光强度或者分别表示扩增时间和荧光强度。在一些实施方案中，本专利技术的方法包括将不同样品放在相同PCR条件下进行扩增。所述相同条件可以是例如相同的PCR扩增体系，相同的DNA聚合酶，相同的PCR扩增条件和/或相同仪器。在一些实施方案中，本专利技术方法中的文库的扩增产物长度相同。在一些实施方案中，本专利技术方法中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定或监测核酸文库复杂程度的方法，所述方法包括以下步骤：1)以文库中的核酸为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线，2)当曲线达到平台期后，将扩增曲线对扩增循环数求导，导数值越小，指示库容越大。

【技术特征摘要】
2017.06.16 CN 20171046174471.一种确定或监测核酸文库复杂程度的方法，所述方法包括以下步骤：1)以文库中的核酸为模板进行PCR扩增，获得扩增曲线，2)当曲线达到平台期后，将扩增曲线对扩增循环数求导，导数值越小，指示库容越大。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述文库为RNA文库，所述方法还包括将RNA文库反转录成cDNA文库，以反转录成的cDNA文库为模板PCR扩增，获得扩增曲线。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中核酸模板是复杂模板，优选的所述核酸文库的复杂程度是变化的，例如是随着筛选而降低的。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述方法包括将不同样品放在相同PCR条件下进行扩增，优选的所述文库的扩增产物长度相同。5.根据权利要求1-4任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗昭锋，方晓娜，王进军，何磊，杨伟丽，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34