本发明专利技术公开了一种检测肺癌骨转移荧光定量PCR的试剂盒。该试剂盒包括以下成分：特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。本发明专利技术还公开了一种检测肺癌骨转移荧光定量PCR试剂盒的使用方法。利用该试剂盒可以快速定量检测novel_mir_89的表达量，从而检测肺癌骨转移的发生情况。本发明专利技术操作简便、快速、结果稳定、灵敏度高且特异性强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测试剂盒，具体而言，涉及一种肺癌骨转移荧光定量PCR检测试剂盒。
技术介绍
目前全世界范围内每年有超过100万的患者被诊断为肺癌，恶性肿瘤可以转移至体内不同的器官，骨转移是恶性肿瘤常见并发症之一。骨组织是恶性肿瘤远处转移最好发的器官，许多类型的恶性肿瘤都可以发生骨转移，引起骨转移的常见肿瘤有乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌等。恶性肿瘤骨转移多发生在50-80岁，40岁以下少见。骨转移可累及全身骨骼，中轴骨(脊柱，骨盆等)及长骨近端是骨转移的好发部位。骨转移常为多发性，少数为单发病变。骨的破坏形式大多为溶骨型，少数为成骨型或两者兼有(混合型)。原发性肺癌骨转移的好发部位依次为胸部、脊柱、骨盆、肢体骨及颅骨，肺循环血·流丰富，癌细胞可循血运到达人全身骨骼系统造成骨转移；肺癌中腺癌的骨转移率高于其他类型原发性肺癌，可能和腺癌的生物学特性有关，腺癌周围型肺癌较多见，容易直接侵犯到肋骨、脊柱又可以通过血路经脊柱静脉和肺静脉达到全身骨骼；也可能和腺癌病人存活时间长有关。肺癌骨转移最常见的类型为溶骨性骨转移，虽然也有局部骨组织的反应性增生，但其主要表现为骨组织的溶解破坏和吸收。成骨性转移以大量病理性成骨为特点，这些新生骨组织呈编织样，不具备正常骨的功能，反而破坏了骨的正常结构，影响骨的正常功能，因此会造成病理性骨折等并发症。病理性成骨的形成是肿瘤细胞与成骨细胞相互作用的结果，但也不能忽视破骨细胞的作用。肿瘤细胞在骨局部通过破骨细胞破坏骨组织的同时，可释放出骨组织中贮存的生长因子如TGFp、IGF等，加上肿瘤细胞自身分泌的BMP，PSA，ET-I等，可刺激成骨细胞的增殖。当成骨细胞活性增高，成骨大于破骨时，就出现了肿瘤性成骨，显示成骨性转移的特殊临床病理表现。混合性转移一般说来，由于骨代谢的特点，成骨及溶骨过程二者相互关联，成骨细胞与破骨细胞在功能上相互依存。因此，肿瘤的骨转移往往都是二者共存，只不过某一过程占据主导地位而已。破骨细胞的激活是所有骨转移发生的重要先决条件。以前列腺癌为例，尽管临床表现以成骨性转移为主，但在转移发生的早期阶段，肿瘤细胞对骨组织的破坏是重要的起始步骤，骨组织中贮存的生长因子如TGFp、IGF等的释放启动了前列腺癌骨转移的过程。随着成骨细胞的激活，病理性成骨逐渐变得明显，最后形成前列腺癌特有的成骨性转移。一般来说，30% -40%的晚期肺癌会发生骨转移，骨转移所致的骨损害将加重患者的病情，引起功能障碍，降低患者的生活质量，甚至缩短生存期。因此，深入研究恶性肿瘤发生骨转移的机制，分析骨转移患者的临床特点，早期诊断骨转移，预防相关并发症，可以提高患者的生活质量，为进一步的治疗提供条件。预测肿瘤骨转移的手段有很多，如影像学诊断X线、CT，ECT，PET ;化学诊断主要包括血清学、生化、免疫学指标的检测；细胞学和病理组织学诊断仅对病人预后和临床治疗方案选择有一定的帮助；基因诊断的敏感性高，但极容易出现假阳性，诊断特异性取决于对靶分子的选择，发展高通量，自动化，集成化，标准化的基因诊断技术是今后的研究方向；骨髓穿刺活检(bone marrow biopsy):骨髓中发现的肿瘤细胞,不仅可以预测骨转移的情况，对预测其它器官如肺、肝的转移也很有临床价值。恶性肿瘤骨转移的诊断方法目前主要依赖病理和影像学检查如穿刺细胞学检查，X线、CT，MR和ECT检查等，尚无特异性实验室诊断方法，目单纯依赖ECT检查来判断骨转移有无及其进展状况，已难以满足临床需求。恶性肿瘤骨转移的诊断方法如能提前，可根据病人实际进行针对性治疗，阻止骨转移的发生，降低其危害。骨转移的发生必定需要基因的调控，基因起作用亦需要上游RNA的调控，所以、以miRNA为诊断检测骨转移的指标可将预测病变的时间大大提前，为阻止骨转移创造更佳的时机并争取更多的时间。 由于miRNA对引起骨转移的基因具有重要调控作用，因此本专利技术针对可引起骨转移病变的miRNA开发出一对特异性引物，并开发制作出试剂盒，并经大群体人群实验验证，结果显示本专利技术设计的可预测肺癌骨转移的试剂盒能有效检测可引起肺癌骨转移miRNA的发生。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测小RNA表达水平的荧光定量PCR试剂盒及使用方法，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。本专利技术的另一目的是在于提供一种荧光定量PCR试剂盒对肺癌是否发生骨转移进行快速的检测。为了实现上述目的，本专利技术首先分别提取了肺癌发生骨转移患者肿瘤细胞和肺癌未发生骨转移患者肿瘤细胞的总RNA,并从中纯化miRNA,利用Single-end library建库方法，共得到两个肺癌骨转移前后肿瘤细胞miRNA转录组文库。对所得的miRNA转录组文库进行高通量测序，对高通量测序序列过滤，去除低质量序列，使用S0AP2方法跟人类基因组进行比对。并对测序结果进行分析，其中通过fold-change方法，对不同样本的表达差异基因进行了比较，得到了表达差异显著的miRNA novel_mir_89，其序列见序列表SEQ ID NO. 5。本专利技术根据noVel_mir_89的序列信息，设计了四条引物，第一条为茎环状结构的反转录引物RT89，其序列见序列表SEQ NO. I ;第二条是上游的特异引物F89，其序列见序列表SEQ NO. 2 ;第三条为下游的通用引物R89，其序列见序列表SEQ NO. 3 ;第四条是在荧光定量PCR中需要的荧光探针引物Flu89，其序列见序列表SEQ NO. 4，在荧光探针Flu89的5’端标有荧光基因FAM，在荧光探针Flu89的3’端标有荧光淬灭基团TAMRA。本专利技术还制备了含有noVel_mir_89序列的标准DNA模板。制备步骤方法如下提取肺癌发生骨转肿瘤细胞的总RNA，从中纯化出miRNA，接着进行逆转录反应，反转录体系为茎环状结构的反转录引物RT89，SEQ ID NO. I (2 μ mol/L) I μ 1，miRNA4y tl, dNTP混合物(每种 2. Smmol /I,) 4 μ 1,0. lmol/L DTT2 μ I, SuperScript RNase H 逆转录酶(200U/μ1)2μ1。反应条件为37°C水浴60分钟，95°C水浴3分钟。将逆转录反应得到的cDNA进行常规PCR扩增，PCR产物检测后切胶回收并纯化，将纯化产物连接到PGM-T克隆载体上，随后转化到DH5a感受态细胞中。通过序列为SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒DNA，质粒DNA采用NanoDrop ND-1000核酸定量仪定量(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备。本专利技术还制备了一种检测novel_mir_89表达水平的突光定量PCR试剂盒，组分如下特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ IDN0.2，下游引物序列为SEQ ID NO. 3，特异性探针的核苷酸序列见本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种miRNA？novel_mir_89的特异性引物及特异性探针，其特征在于，所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为SEQ？ID？NO.2和SEQ？ID？NO.3，特异性探针的核苷酸序列为SEQ？ID？NO.4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨祚璋，谢琳，徐磊，李国奇，
申请(专利权)人：杨祚璋，
类型：发明
国别省市：
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