本发明专利技术公开了一种焦磷酸测序法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及方法。所述试剂盒对ALDH2基因多态性进行检查，具体是指RS671单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ?ID?NO.2—4所示的引物。本发明专利技术的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量对ALDH2基因多态性进行检测，从而达到对酒精耐受的有效预测、预防以及指导临床上硝酸甘油个体化用药。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体的是涉及焦磷酸测序法检测ALDH2基因多态性的试剂盒及方法。
技术介绍
酒精耐受(Alcohol Tolerance)主要指身体对酒精性饮料或食物中乙醇的敏感性下降，包括直接耐受性和诱导耐受性。直接酒精耐受性与个人体型大小有关，诱导耐受指长期饮酒导致的酒精耐受性增高。研究表明环境因素和遗传因素共同影响酒量的个体差异，酒精依赖和酒精过敏很大程度由传因素决定，如乙醛脱氢酶2(ALDH2)是乙醇氧化代谢的主要代谢酶，酒精耐受性与ALDH2的酶活性有关，其多态性也是引起酒精耐受个体差异的主要原因(Circ J. 2011. 75(4) :911-8) ALDH2基因在rs671位点突变后，使504位谷氨酸被赖氨酸替换，突变杂合子(AG)使该酶活性降低，纯合突变(AA)该酶活性消失。该突变使酒精耐受性平均降低84%。ALDH2基因rs671位点突变与酒精耐受性风险关系(HypertensRes. 2009. 32(3) :207-13)基因SNP基因型性别酒精耐受风险OR值GGI AG男0.16 ALDH2rs67lAAU OSGGI AG女0·20 AAU P饮酒是全球普遍流行的的生活方式，但研究表明长期过度饮酒是动脉粥样硬化发病的一个危险因素，如高血压，肥胖，血脂异常以及糖尿病等都与饮酒有关。同时，流行病学研究显示适度的喝酒可通过各种机制降低心血管疾病，如适度饮用温和的酒有利于糖代谢及影响高密度脂蛋白的水平，则会导致高血压及高血脂症，因此通过对ALDH2基因的突变检测，让你了解自己是否能喝酒，酒量如何，耐受程度怎样，帮助你子啊生活中正确控制饮酒量，减少过度饮酒带来身体上的伤害。同时研究也发现，ALDH2基因多态性与硝酸甘油的用药有关。ALDH2酶是硝酸甘油有效代谢物NO形成的关键。当ALDH2基因在rs671位点突变后，酶活性降低，硝酸甘油在体内生物转化过程受阻，有效活性产物NO生成减少，进而导致硝酸甘油治疗心绞痛效果降低。值得注意的是，在亚洲人群中，30%-50%的人都携有rs671位点突变，远远高于欧美人群。国内研究还发现，中国汉族人群中，含服硝酸甘油无效的比例高达25%以上，基因多态性起到了非常重要的作用。因此，对ALDH2基因多态性检测，有助于临床上对硝酸甘油的合理使用。综上，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测ALDH2基因多态性检测试剂盒对酒精耐受评估及硝酸甘油的合理使用，具有重要的临床意义。焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种焦磷酸测序法检测ALDH2基因(SEQ ID NO. I)多态性的试剂 盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测ALDH2SNP。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为一种焦磷酸测序法检测ALDH2基因多态性的试剂盒，包括如下引物(I)扩增引物上游引物5'-GATGTGTTTGGAGCCCAGTC-3' (SEQ ID NO. 2)；下游引物5'-CAGGTCCCACACTCACAGTTTTC-3' (SEQ ID NO. 3)；其中，下游引物的5'进行生物素标记；(2)测序引物5' -GCTGCAGGCATACAC-3' (SEQ ID NO. 4)；试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。一种应用上述试剂盒检测ALDH2基因多态性的方法，包括如下步骤(I) DNA 提取；(2)聚合酶链反应配制50 μ I PCR扩增体系，包含10XPCR buffer 5. O μ I, dNTP I. 5 μ 1,ALDH2±游引物0.5 μ 1，ALDH2下游引物0.5 μ 1，rTaqO. 5 μ 1，水41. O μ 1，模板Ι.Ομ I ;循环程序为95° C 5min预变性；依次在95。C30S，50。C30S，72。C 30S，进行35个循环；72° C保持5min，最终保持在4° C，得扩增产物；(3)焦磷酸测序单链样本纯化；(4)焦磷酸测序及结果分析。本专利技术的试剂盒对ALDH2 RS671目标序列进行分析和检测，该目标序列包括野生型 GGCTGCAGGCATACACTAAAGTGAAAACTGTGAGTGTGG (SEQ ID NO. 5)和突变型 GGCTGCAGGCATACACTGAAGTGAAAACTGTGAGTGTGG (SEQ ID NO. 6);扩增出的片段长为 118bp。由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本专利技术的试剂盒适用于对ALDH2基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上对酒精耐受的评估及硝酸甘油用药的指导。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。附图说明图I为本专利技术ALDH2(RS671)焦磷酸测序结果。具体实施例方式下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。实施例I :ALDH2-pyroF (上游引物)5' -GATGTGTTTGGAGCCCAGTC-3' (SEQ ID NO. 2)；ALDH2-pyroR (下游引物)5' -CAGGTCCCACACTCACAGTTTTC-3' (SEQ ID NO. 3)；测序引物5'-GCTGCAGGCATACAC-3' (SEQ ID NO. 4)；I. DNA 提取I. I实验前试剂材料准备与检查工作如下·(I)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer I和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾V ； (2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的I. 5mL Eppendorf管和各类移液枪头。I. 2从4°C冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；I. 3在I. 5mL Eppendorf管对应标本唯一11"生标识做好标记；I. 4 分别移取 900uL Cell Lysis Solution 加至灭菌的 I. 5mL Eppendorf 管；I. 5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；I. 6 盖上 Eppendorf 管盖，室温孵育 IOmin ；I. 713, OOOrpm 室温离心 20 秒；I. 8取出Eppendorf管,观察白色沉淀；I. 9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；I. 10盖上Eppendorf管,用手指弹击EP管底部,使白色沉淀重悬；1.11移取300111^ Nuclei Lysis Solution 入上述Eppendorf 管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；I. 12 打开 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种焦磷酸测序法检测ALDH2基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物：（1）扩增引物：上游引物：5′？GATGTGTTTGGAGCCCAGTC？3′；下游引物：5′？CAGGTCCCACACTCACAGTTTTC？3′；其中，下游引物的5′进行生物素标记；（2）测序引物：5′？GCTGCAGGCATACAC？3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周宏灏，
申请(专利权)人：周宏灏，
类型：发明
国别省市：
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