一种检测 TYMS mRNA 基因表达量的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测TYMS?mRNA基因表达量的试剂盒及方法。该试剂盒包括用于制作标准曲线的标准品、内参基因实时定量PCR体系。通过该方法能准确、快速、定量地确定TYMS基因表达量。本发明专利技术所述方法和试剂盒应用在临床中，有利于医生合理化选择氟类药物进行治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测TYMS mRNA基因表达量的试剂盒及方法。
技术介绍
氟尿嘧啶(Fluorouraci 1，5_FU)是第一个抗代谢药物，也是目前临床上应用最广泛的抗嘧啶类药物。它对消化道肿瘤及其他实体瘤均有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。5-FU本身没有抗肿瘤活性，当其进入人体后，可被转化为活性代谢产物:一磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUMP)、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUTP)和三磷酸氟尿嘧啶(FUTP)，进而产生抗肿瘤活性。除5-FU，氟类药物还包括替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脱氧氟尿苷以及卡培他滨等。TYMS (Thymidylate Synthetase，TS)基因编码的胸苷酸合成酶，是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，也是5-FU发挥细胞毒作用的目标酶。5-FU转化为FdUMP后，与TS、5，10-亚甲基四氢叶酸结合形成三联复合物，dUMP与TS结合后转化为脱氧胸腺嘧啶核苷dTMP，使DNA合成受限。多种肿瘤的临床研究均显示TYMS mRNA表达水平与5-FU疗效密切相关，例如:结直肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌等。临床研究表明，低TYMS mRNA水平的肿瘤患者接受氟类化疗的效果较好，中位生存期较长。反之，TYMS高表达的患者接受氟类治疗疗效较差(Yasumatsua R et al.Chemotherapy.2009;55:36-41.) 荧光定量PCR技术的出现，为本专利技术提供了一种操作简单快速、易标准化、检测费用低，准确可靠、定量检测mRNA的方法。通过该方法可以快速检测肿瘤细胞(来源于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等)中TYMS mRNA的表达量，用于临床医生对氟尿类的合理化使用。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种检测TYMS基因mRNA表达量的荧光定量PCR检测试剂盒及方法，能简单快速、准确可靠的检测TYMS基因。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为: 一种检测TYMS基因表达量的荧光定量PCR试剂盒，包含以下组成部分: (I )TYMS基因标准品:含有TYMS基因编码序列的重组载体，所述TYMS基因编码序列如SEQ ID N0.1 所示； (2)检测TYMS基因的上、下游引物: TYMS-上游引物:5’ - CAACCCTGACGACAGAAGAATCA -3’ (SEQ ID N0.2)TYMS-下游引物:5，- ATGGCATGGAGGCAGCG -3，(SEQ ID N0.3) 进一步，所述含有TYMS基因编码序列的重组载体的空载体为pUC57载体；进一步，该试剂盒还包含逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT) ,dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。所述逆转录缓冲液为常规逆转录缓冲液，如5X逆转录缓冲液(有浓度为50mmol/L、pH 为 8.0 的 Tris-HCl、浓度为 SOmmoI /I,的 KCl、浓度为 4 mmol /I,的 MgC12 和浓度为10mmol/L的二硫苏糖醇DTT组成)等；所述逆转录引物Oligo-(dT)为寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸；所述dNTPs溶液为dATP (脱氧腺苷三磷酸)的混合水溶液；所述定量PCR缓冲液为常规定量PCR缓冲液，如5 X定量PCR缓冲液(由浓度为lOmmol/L，pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的KCl和浓度为2 mmol/L的MgC12组成)等。本专利技术还提供了基于上述试剂盒检测TYMS mRNA基因表达量的方法，包括以下步骤: (O从待测标本中提取总RNA，测定RNA浓度，加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶，将RNA逆转录为cDNA ；· (2)分别将已知拷贝数的TYMS基因标准品倍比稀释至108、IO7,IO6, ΙΟ5、104、IO3,102、10个拷贝数/ μ 1 ； (3)分别以步骤(I)所制备的待测CDNA及步骤(2)倍比稀释的TYMS基因标准品为模板，加入检测TYMS基因的上、下游引物，定量PCR缓冲液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，进行荧光定量PCR ； (4)由于模板的循环阈值与该模板的初始拷贝数的对数存在线性关系，因此，根据倍比稀释的TYMS基因标准品的循环阈值与初始拷贝数分别绘制TYMS基因标准曲线，再根据待测cDNA的循环阈值对其含有的TYMS基因的初始拷贝数进行定量分析，从标准曲线上读取其含有的TYMS基因的初始拷贝数。进一步，所述步骤(3)的PCR扩增条件为:95°C预变性3分钟，然后95°C变性30秒、57°C退火40秒，共38个循环。本专利技术的定量PCR检测试剂盒，能够灵敏、特异、准确地同时检测TYMS基因，适用于临床上对氟尿类疗效反应的评价，利于临床医生对治疗方案做出合理的选择。附图说明图1为本专利技术/m 基因的标准曲线； 图2为本专利技术/7# 基因的溶解曲线； 图3为本专利技术/7# 基因的扩增曲线。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。一、TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒的配置 本实施例的TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒，包括以下组成部分: 1)TYMS基因标准品:含有TYMS基因编码序列(GeneBank编号为匪001071.2的第649位至第728位碱基)的重组pUC57载体； 2)检测TYMS基因的上、下游引物: TYMS-上游引物:5’ - CAACCCTGACGACAGAAGAATCA -3’ (SEQ ID N0.2)TYMS-下游引物:5，- ATGGCATGGAGGCAGCG -3，(SEQ ID N0.3)； 3) 5X逆转录缓冲液，浓度为lOpmol/μ I的逆转录引物Olig0-(dT) 16，浓度为20pmol/ μ I的dNTPs溶液，浓度为IOU/ μ I的M-MLV逆转录酶，5 X定量PCR缓冲液，浓度为2U/ μ I的TaqDNA聚合酶。其中，TYMS基因标准品由以下方法制得: a)直接合成获得含有TYMS基因编码序列的片段DNA； b)经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯化后，克隆至PUC57载体进行连接； c)连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，筛选阳性克隆； d)提取重组质粒，即得分别含有TYMS基因编码序列的重组PUC57载体。此外，逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶均为RT-PCR的常规试剂，故本专利技术的检测试剂盒也可以不包括上述常规试剂。二、TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测 本实施例的TYMS基因的荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤: (1)从待测外周血、肿瘤组织、穿刺标本或其它标本中提取总RNA，测RNA的浓度； (2)将所得RNA逆转录为cDNA，转录体系如表I所示: 表I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测?TYMS?mRNA?基因表达量的试剂盒，其特征在于：包括以下组成部分：（1）TYMS基因标准品：含有TYMS基因编码序列的重组载体，所述TYMS基因编码序列如SEQ?ID?NO.1所示；（2）检测TYMS基因的上、下游引物：TYMS?上游引物：5’??CAACCCTGACGACAGAAGAATCA??3’；TYMS?下游引物：5’??ATGGCATGGAGGCAGCG??3’。

【技术特征摘要】
1.一种检测TYMS mRNA基因表达量的试剂盒，其特征在于:包括以下组成部分: (I )TYMS基因标准品:含有TYMS基因编码序列的重组载体，所述TYMS基因编码序列如SEQ ID N0.1 所示； (2)检测TYMS基因的上、下游引物: TYMS-上游引物:5’ - CAACCCTGACGACAGAAGAATCA -3’ ； TYMS-下游引物:5，- ATGGCATGGAGGCAGCG -3，。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述重组载体的空载体为PUC57载体。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。4.一种基于权利要求1至3任一项所述试剂盒检测TYMS mRNA基因表达量的方法，包括如下步骤: (O从待测标本中提取总RNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭成贤，张伟，陈小平，刘昭前，周宏灏，
申请(专利权)人：周宏灏，
类型：发明
国别省市：